Вы здесь

Биолюминесцентный метод определения количества живых микроорганизмов

Средняя: 5 (1 оценка)
Методы в биотехнологии

Производство сухих бактериальных препаратов основано на использовании культур микроорганизмов. Длительное сохранение жизнеспособности штамма требует определенных условий и достигается в настоящее время несколькими способами: периодическим рекультивуванням в случае стабильных штаммов, хранением в глубоко замороженном или лиофилизированном состоянии. Последний метод позволяет длительное время сохранять почти без изменений все свойства биопрепарата или продуцента, не требует больших экономических затрат при применении и хранении.

Однако лиофилизация бактериальных культур - сложный технологический процесс, в результате которого некоторая часть микроорганизмов отмирает. Поэтому необходимо разработать такие условия лиофилизации, позволяющие сохранять наибольший процент жизнеспособных клеток после высушивания.

Анализ отечественной и зарубежной литературы показал, что большинство физических, химических и биологических процессов при производстве сухих биопрепаратов влияют на количество живых микробных клеток в конечном продукте.

Метод определения КОЕ является трудоемким, субъективным и требует много времени на выращивание и подсчет колоний. Поэтому при разработке оптимальных условий лиофилизации исследователи, изменяя какой-либо параметр сублимационной сушки, редко определяют непосредственно выживаемость микроорганизмов после лиофилизации, а чаще измеряют остаточную влажность препарата, которая, как показывают литературные данные, влияет на сохранение живых бактерий в ходе длительного хранения.

В настоящее время в биотехнологических производствах все шире используют ускоренные (косвенные) методы определения титра клеток. Эти методы основаны на измерении какого-либо физико-химического параметра образца, абсолютная величина которого или ее изменение пропорциональна количеству жизнеспособных клеток в образце. Среди большого разнообразия методов, используемых для этих целей, высокой точностью, воспроизводимостью и экономичностью отличаются методы, основанные на определении содержания различных внутриклеточных или внеклеточных метаболитов, в первую очередь, внутриклеточного аденозинтрифосфата (АТФ).

АТФ - универсальный внутриклеточный метаболит, который содержится в относительно высоких концентрациях в клетках любых микро-и макроорганизма. Его количество с большой точностью можно определить с помощью биолюминесцентного метода даже при ультрамалых содержании в образце.

После гибели клетки содержание АТФ, в отличие от других внутриклеточных метаболитов, резко снижается в течение нескольких секунд. Поэтому по содержанию внутриклеточного АТФ в рассматриваемом образце можно определять только жизнеспособные клетки. Это представляет практический интерес для подсчета количества живых микроорганизмов в препаратах, подвергающихся значительным стрессовым воздействиям (замораживание, лиофилизация и др.).

В настоящее время процедура биолюминесцентного определения АТФ получила достаточное распространение в различных областях биометрии. Многие фирмы делают коммерчески доступные АТФ-реагенты и приборы для детекции биолюминесценции - люминометры, как портативные, так и стационарные. Их стоимость, по сравнению с большинством оптических приборов, невелика. Все это обусловливает возможность широкого практического использования биолюминесцентного метода в биотехнологических производствах. Следует отметить, что биологические образцы, как правило, кроме микробного (целевого) АТФ содержат соматический и / или внеклеточный АТФ в концентрациях, часто превышают концентрацию целевого на несколько порядков. Поэтому для правильного определения микробного АТФ необходимо проводить специальную пробоподготовку образца включает такие стадии, как концентрирования микробных клеток и / или удаления из образца нецелевого АТФ.

Добавить комментарий

CAPTCHA
Этот вопрос задается для того, чтобы выяснить, являетесь ли Вы человеком или представляете из себя автоматическую спам-рассылку.