Вы здесь

Биотехнологические аспекты исследования рода Clematis L.

Средняя: 5 (1 оценка)
Clematis vitalba

Тривиальное (бытовое) название «клематисы» объединяет представителей сем. Ranunculaceae (Лютиковых) рода Clematis (Ломонос), в который часто включают подрод Atragene (Княжик) [2, 50, 76, 80]. Растения этой систематической группы уникальны по своему широкому народохозяйственному значению: имеют высокие декоративные качества для использования в озеленении. Благодаря содержанию эфирных масел, фитонцидов, фунгицидов, витаминов, дубильных веществ и сапонинов представители рода Ломонос и подрода Княжик привлекают интерес исследователей в различных областях биологии, химии, медицины и фармакологии [31, 50, 51, 67, 68, 106, 125, 182]. Ряд видов рода используется в традиционной тибетской индийской, китайской и монгольской медицине [125, 184, 225]. В связи с этим, применение биотехнологических подходов для получения клематисов, как посадочного материала и как сырья для медицинской промышленности сегодня является одним из приоритетных направлений современной биотехнологии. В научной литературе сведения о введении в культуру in vitro представителей рода Clematis скудны и отрывочны. Первое информационное сообщение о биотехнологических исследованиях представителей этого рода относится к 1975 году: Г. С. Романовой исследовались биологические особенности прорастания семян клематиса в условиях in vitro [146]. Более поздние биотехнологические исследования этой группы растений носят в основном чисто прикладной характер и касаются вопросов получения посадочного материала различных декоративных и лекарственных форм клематисов путем индукции различных путей морофгенеза in vitrо. Как свидетельствуют данные литературы использование методов получения посадочного материала Clematis в условиях in vitro предпочтительнее перед традиционным (черенкование одревесневшими или зелеными черенками) [50, 120], так как позволяет получать посадочный материал, сходный по фенотипу с материнским растением и более просто укореняющийся традиционными методами [219, 230, 231], кроме того генетически гетерогенный посадочный материал, полученный в ходе биотехнологических исследований, является ценным исходным материалом для селекции [80, 186].

Получение посадочного материала клематисов на основе метода культуры тканей состоит из нескольких этапов: выбор типа первичного экспланта, подбор химических (минерального, углеводного и фитогормонального состава сред), и физических (температура, освещенность) параметров культивирования (как для получения первичного каллуса, так и растений-регенерантов), подбора условий культивирования для укоренения полученных растеньиц. При реализации органогенного потенциала у представителей рода Clematis необходимо учитывать генетические особенности исходных растений (сорт, вид), тип используемого экспланта, их физиологическое состояние (сроки введения в культуру), состав питательных сред и условия их культивирования [80, 109, 219]. Первым этапом получения посадочного материала является подбор экспланта и сроков введения в условия in vitro. Для получения органогенного каллуса в культуре тканей Clematis filamentosa Dumn. исследователи из Китая оптимальным эксплантом считают меристемы молодых побегов [230], а для такого ценного лекарственного вида как Л. Гурина (Clematis gouriana Roxb.) исследователи из Индии фрагменты стеблей длинной 2-4 см [225]. Для получения первичного морфогенного каллуса 8-ми садовых форм декоративных клематисов И. В. Митрофановой (Украина) также использовались меристемы из почек побегов при изолировании их в период с февраля по апрель месяц. При этом количество эксплантов, способных к различным путям морофгенеза в зависимости от генотипа, достигала 90-100 % [109]. Для микроклонального размножения гибрида Clematis × jackmanii румынскими исследователями в качестве эксплантов использовались пазушные почки однолетних побегов, вводимые в условия in vitro в марте или июле [198]. В работе О. И. Короткова (Россия) для микроклонального размножения декоративных клематисов, относящихся к 8-ми садовым группам, в качестве первичных эксплантов использовались конусы нарастания побегов, при их изолировании в апреле-мае [80].

Для размножения ломоносов путем индукции соматического эмбриоидогенеза исследователями также применяются различные типы эксплантов. Так, в работе И. В. Митрофановой использовались как высечки листьев, так и меристемы [109], а в работах других авторов – как незрелые зиготические зародыши [186, 198, 217], так и вегетативные органы [80, 225, 230]. Вторым этапом успешного размножения клематисов является оптимизация питательных сред и условий культивирования. В большинстве работ исследователи как для получения первичного морфогенного каллуса, так и первичной культуры меристем используют питательные среды по прописи МС [80, 109, 217, 225, 230]. Однако, в работе румынских авторов при подборе оптимальной питательной среды для микроклонального размножения гибрида Clematis × jackmanii из трех испытанных сред (по прописям Murashige, Skoog(1962); Lee, Fossard(1972); Quoirin, Lepoivre(1977)) оптимальной оказалась среда Quoirin & Lepoivre, при культивировании на которой коэффициент размножения к 5-му пассажу (10,5 микропобегов/эксплант) оказался наивысшим [198].

В большинстве изученных литературных источников в качестве источника углерода учеными используется сахароза в концентрации 20-30 г/л [80, 109, 198, 217, 225, 230].

Рассматривая влияние регуляторов роста, на процессы размножения изучаемых объектов, следует отметить, что чаще всего как для индукции образования морфогенного каллуса, так и регуляции направленности морфогенетических процессов в условиях іn vіtro используются ауксины (НУК, ИУК, ИМК) и цитокинины (БАП, кинетин, зеатин). Для размножения Clematis filamentosa индукцию образования морфогенного каллуса проводили при культивировании эксплантов на среде МС, дополненной НУК 0,1 мг/л и БАП 0,5 мг/л, а для пролиферации почек образовавшийся каллус пересаживали на питательные среды с уменьшенным вдвое количеством НУК [230].

В эксперименте по индукци каллусообразования экспланты Clematis gouriana культивировали на средах, дополненных 0,5-1,5 мг/л БАП и 0,1-0,5 мг/л НУК, а так же средах, содержащих БАП и 2,4-Д в концентрации от 1,5 до 2,5 мг/л. При культивировании на птательных средах с БАП и НУК образовывался морфогенный каллус. На питательной среде, где НУК заменяли 2,4-Д, подавлялось как образование каллуса, так и развитие почек. В случае перенесения каллуса на питательную среду с различными сочетаниями ауксинов и цитокининов (БАП+НУК; кинетин+ИМК, 2,4-Д+кинетин) показаны различные морфогенетические реакции. Сочетание БАП+НУК показало возможность образования 2-3 почек на трансплант, 2,4-Д+кинетин – только стимулировали каллусообразование; а ИМК+кинетин в широких пределах концентраций (3,5-4,5 мг/л кинетина в сочетании с 0,3-0,7 мг/л ИМК) позволили получить органогенный каллус и регенерировать растения. Причем максимальное число почек-регенерантов образовывалось в варианте культивирования каллуса на питательной среде, дополненной 4,0 мг/л кинетина и 0,5 мг/л ИМК [225].

Для размножения гибрида Clematis integrifolia × Clematis viticella путем непрямого соматического эмбриогенеза экспланты культивировали в темноте на среде, содержащей БАП в концентрации 2 мкМ и 0,5 мкМ, а для монополярного морфогенеза каллус культивировали на питательной среде, содержащей 10 мкМ кинетина и 1 мкМ БАП [217]. Как указывает И. В. Митрофанова, для индукции процессов дедифференциации, а затем и непрямого соматического эмбриоидогенеза у восьми сортов декоративних клематисов является необходимым присутствие в питательной среде зеатина в концентрации 1,8-2,22 мкМ, а для индукции адвентивного побегообразования оптимальным типом экспланта является каллус листового происхождения диаметром 7-10 мм при его культивировании на питательной среде МС, дополненной 2,3 мкМ зеатина. При этом образующиеся эмбриоиды проходят те же стадии развития, что и нормальные зиготические зародыши. В работе указано, что развитие соматических зародышей ломоносов в условиях in vitro зависело от их морфологического типа. Из выявленных автором 7-ми морфологических типов соматических зародышей, образовавшихся в условиях in vitro, только четыре имели регенерационный потенциал [109, 186].

Рассматривая влияние регуляторов роста на процесс клонального микроразмножения сортов декоративных клематисов, О. И. Коротков отмечает, что совместное использование БАП с ИУК в большинстве случаев не оказывало положительного влияния на коэффициент размножения по сравнению с одним БАП. Максимальный коэффициент отмечен на среде, дополнгенной БАП в концентрации 1 мг/л [80]. Рассматривая особенности протекания процессов морофгенеза у различных генотипов декоративных клематисов авторы [80, 109] отмечают, что направленность морофгенетических реакций в большей степени зависит от генотипа материнского растения, что в конечном итоге отражает эндогенное содержание ростовых веществ в эксплантах, которое является генетически обусловленным. Последний этап получения посадочного материала клематисов перед их адаптацией к условиям in vivo – укоренение. Процесс этот происходит сравнительно просто при использовании тех же питательных сред, что и на этапе размножения, с той лишь разницей, что из их состава исключают цитокинины [80, 225, 230].

Кроме процессов получения посадочного материала ломоносов, в условиях in vitro исследованы также вопросы о влиянии минерального и углеводного питания (содержания сахарозы, и азота в питательной среде) на метаболизм некоторых пигментов. Так, в работе польских авторов [214] показано, что содержание хлорофиллов и антоцианов в побегах Clematis pitcheri при культивировании их побегов в условиях in vitro при различных температурах было различным. Так, в проростках, полученных при 20 C, содержание хлорофилла было высоким, а при 15 °C – низким. При этом содержание сахарозы в среде не оказывало или оказывало несущественное влияние на накопление хлорофилла. Нижний уровень содержания азота в среде (50 % N) стимулировал накопление хлорофилла в проростках, по сравнению с нормальным содержанием азота (100 % N), максимальные различия при этом отмечены для температуры 15 °CLEMATIS Значительно повышало накопление антоцианов высокое содержание в среде сахарозы (30 г/л) и азота (100 % N) при низкой температуре (15 °C). Снижение уровня соединений азота до 50 % и концентрации сахарозы до 10 г/л приводит к уменьшению содержания антоцианов в случае культивирования при 15°C и 20° CLEMATIS В случае культивирования эксплантов при 25° C влияние накопления сахарозы и азота на накопление антоцианов не проявлялось или было несущественным [214].

В литературе так же имеются единичные сведения об использовании эмбриокультуры незрелых гибридных зародышей двух различных видов клематиса – с травянистым и деревянистым стеблями. При этом культивирование гибридных зародышей, полученных in vivo, после перенесения их в условия in vitro повышало выживаемость гибридных проростков на 50 %. Авторы указывают на то, что при выращивании в условиях in vitro некоторые из введенных в культуру зиготических зародышей способны к образованию эмбриогенного каллуса, что открывает возможности для селекции, так как такие соматические зародыши могут быть источником повышенного генетического и фенотипического разнообразия полученных гибридных форм [186].

Так как работы, направленные на получение и последующее исследование культур-продуцентов вторичных метаболитов, имеют ценность не только в практическом, но и в теоретическом плане, так как ряд вопросов, связанных с механизмами запуска программы биосинтеза вторичных метаболитов, остается до сих про не выясненными. Наряду с этим, сведения в научной литературе, касающиеся взаимосвязи процессов вторичной дифференциации и накопления продуктов вторичного обмена клетками и тканями, культивируемыми in vitro отрывочны, противоречивы и явно недостаточны [25, 27, 52, 66, 89, 107, 115, 167].

В связи с вышеизложенным, изучение особенностей введения в асептическую культуру CLEMATIS vitalba, выявление индуцирующего действия различных факторов культивирования на процессы дедифференциации и каллусообразования, и исследование закономерностей накопления сапонинов в культивируемых in vitro тканях этого вида представляется актуальным и перспективным.

Фото (Clematis vitalba) в статье взято с сайта uni-graz.at

Ссылки на литературу в тексте соответствуют источнику.

Источник: Сидякин А.И., Индуцированный морфогенез in vitro и накопление тритерпеновых гликозидов в каллусных культурах ломоноса виноградолистного (Clematis vitalba L.): Дис. … канд. биол. наук. Симферополь. 2011. – 217 с.

Материал любезно предоставил Сидякин Андрей Иванович – к.б.н., ас. каф. ботаники и физиологии растений и биотехнологий и м.н.с. Биотехнологического центра НИЧ Таврического национального университета им. В.И. Вернадского, научный консультант ООО КрымБио

Добавить комментарий

CAPTCHA
Этот вопрос задается для того, чтобы выяснить, являетесь ли Вы человеком или представляете из себя автоматическую спам-рассылку.