Тривиальное (бытовое) название «клематисы» объединяет представителей сем. Ranunculaceae (Лютиковых) рода Clematis (Ломонос), в который часто включают подрод Atragene (Княжик) [2, 50, 76, 80]. Растения этой систематической группы уникальны по своему широкому народохозяйственному значению: имеют высокие декоративные качества для использования в озеленении. Благодаря содержанию эфирных масел, фитонцидов, фунгицидов, витаминов, дубильных веществ и сапонинов представители рода Ломонос и подрода Княжик привлекают интерес исследователей в различных областях биологии, химии, медицины и фармакологии [31, 50, 51, 67, 68, 106, 125, 182]. Ряд видов рода используется в традиционной тибетской индийской, китайской и монгольской медицине [125, 184, 225]. В связи с этим, применение биотехнологических подходов для получения клематисов, как посадочного материала и как сырья для медицинской промышленности сегодня является одним из приоритетных направлений современной биотехнологии. В научной литературе сведения о введении в культуру in vitro представителей рода Clematis скудны и отрывочны. Первое информационное сообщение о биотехнологических исследованиях представителей этого рода относится к 1975 году: Г. С. Романовой исследовались биологические особенности прорастания семян клематиса в условиях in vitro [146]. Более поздние биотехнологические исследования этой группы растений носят в основном чисто прикладной характер и касаются вопросов получения посадочного материала различных декоративных и лекарственных форм клематисов путем индукции различных путей морофгенеза in vitrо. Как свидетельствуют данные литературы использование методов получения посадочного материала Clematis в условиях in vitro предпочтительнее перед традиционным (черенкование одревесневшими или зелеными черенками) [50, 120], так как позволяет получать посадочный материал, сходный по фенотипу с материнским растением и более просто укореняющийся традиционными методами [219, 230, 231], кроме того генетически гетерогенный посадочный материал, полученный в ходе биотехнологических исследований, является ценным исходным материалом для селекции [80, 186].
Получение посадочного материала клематисов на основе метода культуры тканей состоит из нескольких этапов: выбор типа первичного экспланта, подбор химических (минерального, углеводного и фитогормонального состава сред), и физических (температура, освещенность) параметров культивирования (как для получения первичного каллуса, так и растений-регенерантов), подбора условий культивирования для укоренения полученных растеньиц. При реализации органогенного потенциала у представителей рода Clematis необходимо учитывать генетические особенности исходных растений (сорт, вид), тип используемого экспланта, их физиологическое состояние (сроки введения в культуру), состав питательных сред и условия их культивирования [80, 109, 219]. Первым этапом получения посадочного материала является подбор экспланта и сроков введения в условия in vitro. Для получения органогенного каллуса в культуре тканей Clematis filamentosa Dumn. исследователи из Китая оптимальным эксплантом считают меристемы молодых побегов [230], а для такого ценного лекарственного вида как Л. Гурина (Clematis gouriana Roxb.) исследователи из Индии фрагменты стеблей длинной 2-4 см [225]. Для получения первичного морфогенного каллуса 8-ми садовых форм декоративных клематисов И. В. Митрофановой (Украина) также использовались меристемы из почек побегов при изолировании их в период с февраля по апрель месяц. При этом количество эксплантов, способных к различным путям морофгенеза в зависимости от генотипа, достигала 90-100 % [109]. Для микроклонального размножения гибрида Clematis × jackmanii румынскими исследователями в качестве эксплантов использовались пазушные почки однолетних побегов, вводимые в условия in vitro в марте или июле [198]. В работе О. И. Короткова (Россия) для микроклонального размножения декоративных клематисов, относящихся к 8-ми садовым группам, в качестве первичных эксплантов использовались конусы нарастания побегов, при их изолировании в апреле-мае [80].
Для размножения ломоносов путем индукции соматического эмбриоидогенеза исследователями также применяются различные типы эксплантов. Так, в работе И. В. Митрофановой использовались как высечки листьев, так и меристемы [109], а в работах других авторов – как незрелые зиготические зародыши [186, 198, 217], так и вегетативные органы [80, 225, 230]. Вторым этапом успешного размножения клематисов является оптимизация питательных сред и условий культивирования. В большинстве работ исследователи как для получения первичного морфогенного каллуса, так и первичной культуры меристем используют питательные среды по прописи МС [80, 109, 217, 225, 230]. Однако, в работе румынских авторов при подборе оптимальной питательной среды для микроклонального размножения гибрида Clematis × jackmanii из трех испытанных сред (по прописям Murashige, Skoog(1962); Lee, Fossard(1972); Quoirin, Lepoivre(1977)) оптимальной оказалась среда Quoirin & Lepoivre, при культивировании на которой коэффициент размножения к 5-му пассажу (10,5 микропобегов/эксплант) оказался наивысшим [198].
В большинстве изученных литературных источников в качестве источника углерода учеными используется сахароза в концентрации 20-30 г/л [80, 109, 198, 217, 225, 230].
Рассматривая влияние регуляторов роста, на процессы размножения изучаемых объектов, следует отметить, что чаще всего как для индукции образования морфогенного каллуса, так и регуляции направленности морфогенетических процессов в условиях іn vіtro используются ауксины (НУК, ИУК, ИМК) и цитокинины (БАП, кинетин, зеатин). Для размножения Clematis filamentosa индукцию образования морфогенного каллуса проводили при культивировании эксплантов на среде МС, дополненной НУК 0,1 мг/л и БАП 0,5 мг/л, а для пролиферации почек образовавшийся каллус пересаживали на питательные среды с уменьшенным вдвое количеством НУК [230].
В эксперименте по индукци каллусообразования экспланты Clematis gouriana культивировали на средах, дополненных 0,5-1,5 мг/л БАП и 0,1-0,5 мг/л НУК, а так же средах, содержащих БАП и 2,4-Д в концентрации от 1,5 до 2,5 мг/л. При культивировании на птательных средах с БАП и НУК образовывался морфогенный каллус. На питательной среде, где НУК заменяли 2,4-Д, подавлялось как образование каллуса, так и развитие почек. В случае перенесения каллуса на питательную среду с различными сочетаниями ауксинов и цитокининов (БАП+НУК; кинетин+ИМК, 2,4-Д+кинетин) показаны различные морфогенетические реакции. Сочетание БАП+НУК показало возможность образования 2-3 почек на трансплант, 2,4-Д+кинетин – только стимулировали каллусообразование; а ИМК+кинетин в широких пределах концентраций (3,5-4,5 мг/л кинетина в сочетании с 0,3-0,7 мг/л ИМК) позволили получить органогенный каллус и регенерировать растения. Причем максимальное число почек-регенерантов образовывалось в варианте культивирования каллуса на питательной среде, дополненной 4,0 мг/л кинетина и 0,5 мг/л ИМК [225].
Для размножения гибрида Clematis integrifolia × Clematis viticella путем непрямого соматического эмбриогенеза экспланты культивировали в темноте на среде, содержащей БАП в концентрации 2 мкМ и 0,5 мкМ, а для монополярного морфогенеза каллус культивировали на питательной среде, содержащей 10 мкМ кинетина и 1 мкМ БАП [217]. Как указывает И. В. Митрофанова, для индукции процессов дедифференциации, а затем и непрямого соматического эмбриоидогенеза у восьми сортов декоративних клематисов является необходимым присутствие в питательной среде зеатина в концентрации 1,8-2,22 мкМ, а для индукции адвентивного побегообразования оптимальным типом экспланта является каллус листового происхождения диаметром 7-10 мм при его культивировании на питательной среде МС, дополненной 2,3 мкМ зеатина. При этом образующиеся эмбриоиды проходят те же стадии развития, что и нормальные зиготические зародыши. В работе указано, что развитие соматических зародышей ломоносов в условиях in vitro зависело от их морфологического типа. Из выявленных автором 7-ми морфологических типов соматических зародышей, образовавшихся в условиях in vitro, только четыре имели регенерационный потенциал [109, 186].
Рассматривая влияние регуляторов роста на процесс клонального микроразмножения сортов декоративных клематисов, О. И. Коротков отмечает, что совместное использование БАП с ИУК в большинстве случаев не оказывало положительного влияния на коэффициент размножения по сравнению с одним БАП. Максимальный коэффициент отмечен на среде, дополнгенной БАП в концентрации 1 мг/л [80]. Рассматривая особенности протекания процессов морофгенеза у различных генотипов декоративных клематисов авторы [80, 109] отмечают, что направленность морофгенетических реакций в большей степени зависит от генотипа материнского растения, что в конечном итоге отражает эндогенное содержание ростовых веществ в эксплантах, которое является генетически обусловленным. Последний этап получения посадочного материала клематисов перед их адаптацией к условиям in vivo – укоренение. Процесс этот происходит сравнительно просто при использовании тех же питательных сред, что и на этапе размножения, с той лишь разницей, что из их состава исключают цитокинины [80, 225, 230].
Кроме процессов получения посадочного материала ломоносов, в условиях in vitro исследованы также вопросы о влиянии минерального и углеводного питания (содержания сахарозы, и азота в питательной среде) на метаболизм некоторых пигментов. Так, в работе польских авторов [214] показано, что содержание хлорофиллов и антоцианов в побегах Clematis pitcheri при культивировании их побегов в условиях in vitro при различных температурах было различным. Так, в проростках, полученных при 20 C, содержание хлорофилла было высоким, а при 15 °C – низким. При этом содержание сахарозы в среде не оказывало или оказывало несущественное влияние на накопление хлорофилла. Нижний уровень содержания азота в среде (50 % N) стимулировал накопление хлорофилла в проростках, по сравнению с нормальным содержанием азота (100 % N), максимальные различия при этом отмечены для температуры 15 °CLEMATIS Значительно повышало накопление антоцианов высокое содержание в среде сахарозы (30 г/л) и азота (100 % N) при низкой температуре (15 °C). Снижение уровня соединений азота до 50 % и концентрации сахарозы до 10 г/л приводит к уменьшению содержания антоцианов в случае культивирования при 15°C и 20° CLEMATIS В случае культивирования эксплантов при 25° C влияние накопления сахарозы и азота на накопление антоцианов не проявлялось или было несущественным [214].
В литературе так же имеются единичные сведения об использовании эмбриокультуры незрелых гибридных зародышей двух различных видов клематиса – с травянистым и деревянистым стеблями. При этом культивирование гибридных зародышей, полученных in vivo, после перенесения их в условия in vitro повышало выживаемость гибридных проростков на 50 %. Авторы указывают на то, что при выращивании в условиях in vitro некоторые из введенных в культуру зиготических зародышей способны к образованию эмбриогенного каллуса, что открывает возможности для селекции, так как такие соматические зародыши могут быть источником повышенного генетического и фенотипического разнообразия полученных гибридных форм [186].
Так как работы, направленные на получение и последующее исследование культур-продуцентов вторичных метаболитов, имеют ценность не только в практическом, но и в теоретическом плане, так как ряд вопросов, связанных с механизмами запуска программы биосинтеза вторичных метаболитов, остается до сих про не выясненными. Наряду с этим, сведения в научной литературе, касающиеся взаимосвязи процессов вторичной дифференциации и накопления продуктов вторичного обмена клетками и тканями, культивируемыми in vitro отрывочны, противоречивы и явно недостаточны [25, 27, 52, 66, 89, 107, 115, 167].
В связи с вышеизложенным, изучение особенностей введения в асептическую культуру CLEMATIS vitalba, выявление индуцирующего действия различных факторов культивирования на процессы дедифференциации и каллусообразования, и исследование закономерностей накопления сапонинов в культивируемых in vitro тканях этого вида представляется актуальным и перспективным.
Фото (Clematis vitalba) в статье взято с сайта uni-graz.at
Ссылки на литературу в тексте соответствуют источнику.
Источник: Сидякин А.И., Индуцированный морфогенез in vitro и накопление тритерпеновых гликозидов в каллусных культурах ломоноса виноградолистного (Clematis vitalba L.): Дис. … канд. биол. наук. Симферополь. 2011. – 217 с.
Материал любезно предоставил Сидякин Андрей Иванович – к.б.н., ас. каф. ботаники и физиологии растений и биотехнологий и м.н.с. Биотехнологического центра НИЧ Таврического национального университета им. В.И. Вернадского, научный консультант ООО КрымБио