Методика изучения эмбриогенеза кукурузы in vivo
Рассмотрим исследования по изучению динамики эмбрионального периода развития зародыша в естественных условиях у модельного гибрида кукурузы. Объектом исследований является позднеспелый гибрид кукурузы. Материалом исследования — зерновки различного возраста модельного позднеспелого гибрида кукурузы.
Изоляция растений
Эмбриогенез растений in vivo изучается непосредственно в полевых условиях или условиях лабораторных теплиц на растениях, вырощенных в грунте с мая по август по общепринятой методике выращивания. Для изучения эмбриогенеза кукурузы in vivo проводится искусственная изоляция мужских и женский половых органов в период цветения, метелки, которая начала раскрывать пыльники (раскрытие на 1/3) и початка кукурузы, до начала выбрасывания первых рылец, соответсвенно. Изоляцию метелки кукурузы проводят бумажным пакетом, в который осыпется зрелая пыльца. Початок кукурузы изолируют прозрачным пакетом, чтобы видеть когда появятся нитки-щелк-рыльца кукурузы.
Опыление растений
Собранную таким образом пыльцу кукурузы используют через 2-е суток на 3-и сбора пыльцы, но не позже, так как пыльца которая осыпалась отомрет. Раньше опылять тоже не целесообразно так как еще не все пыльники открылись и количество пыльцы будет не максимальное. Опыляют початки кукурузы собранной пыльцой при длине рыльцей початка приблизительно 3 см. Кукуруза является перекрестным ветроопыляемым однодомным растением. Тоесть початок и метелка (женская и мужская половая форма), которые находятся на одном растении, вызревают в разное время. Изолированные в период цветения, початки одного растения кукурузы опыляли пыльцой другого растения кукурузы. Таким образом, зародыши от такого скрещивания имели смешанный материнско-отцовский генотип.
Морфометрический анализ, фиксация и проводка через спирты исследуемого материала — зерновок кукурузы
Дальнейшие процессы оплодотворения, роста и развития элементов зерновки: зародыша и эндосперма, происходили также изолированно под пергаментными изоляторами. Эмбриогенез исследовали на постоянных микроскопических препаратах по методике З.П. Паушевой (1971). В ходе исследования была использована методика темпоральной фиксации, начиная с первых суток после опыления до четырнадцатых. Это позволило определить хронометрически последовательность и темп образования генеративных органов, развития женского гаметофита, различных звеньев прогамии и слияния половых клеток, а также раннего эмбриогенеза кукурузы. Фиксацию сегментов початков с зерновками проводили фиксатором FAA (40 % формалин – 7 мл, ледяная уксусная кислота – 7 мл, 70° спирт – 100 мл) на протяжении двух суток. После фиксации материал отмывали от фиксатора 70° этиловым спиртом в течение двух часов и хранили фиксированный материал в чистом 70° спирте. Далее материал обезвоживали путём смены спиртов нарастающей концентрации и переводили его в хлороформ, а затем в парафин. Для этого в начале проводки в стеклянные не большие бюксы отбираются по 10-15 шт. материала (предварительно измеренные и сфотографированные). Дальнейшая проводка проводилась по схеме, описанной в статье «Постоянные микроскопические препараты. Часть 1. Фиксация и проводка«. Морфометрический анализ предполагает осуществление линейных замеров зерновок кукурузы темпорально.
Далее для изучения эмбриогенеза кукурузы in vivo продят изготовление постоянных микроскопических препаратов по известным методикам, которые изложены в следующих статьях: «Постоянные микроскопические препараты. Часть 2. Закапывание блоков«, «Постоянные микроскопические препараты. Часть 3. Нарезание на микротоме«, «Постоянные микроскопические препараты. Часть 4. Наклейка микротомных срезов материала на предметные стекла«, «Постоянные микроскопические препараты. Часть 5. Окраска постоянных препаратов и наклейка покровных стекол«.
Полученные, по выше описанной методике, постоянные микроскопические препараты изучаются под микроскопом и устанавливается развитие зародыша, т.е. эмбриогенез кукурузы на билатеральных и дорсовентральных срезах зерновок кукурузы.
Автор статьи и фото в статье: Ляпустина Е.В.