Вы здесь

Искусственное оплодотворение растений

Средняя: 3.5 (4 оценок)
Искусственное оплодотворение растений

В последнее время обострился интерес к изучению механизмов половой репродукции у цветковых растений на качественно новом уровне [1, 2, 4, 11, 12, 14]. Разработанная техника получения изолированных жизнеспособных гамет позволяет осуществлять процесс искусственного оплодотворения растений in vitro. Для этого неподвижные гаметы приводят в контакт и создают условия для их слияния. Экспериментально определены необходимые значения рН, осмотического давления и состав питательной среды, окружающей гаметы в данный момент. К настоящему времени для кукурузы предложено несколько подходов к искусственному оплодотворению in vitro. Один из них связан с электрослиянием гамет. Гаметы собирают, переносят в микрокаплю 0,5 г маннитола под слоем минерального масла [5], погружают в эту каплю электроды и осуществляют слияние. Процент гамет, слившихся таким образом с образованием зиготы, составил 80%.

Е. Kranz et al. [6] получили регенерацию с зигот, образованных электрослиянием изолированных спермиев и яйцеклеток. Первому делению зиготы предшествовало неравномерное распределение органелл. Как и при in vivo оплодотворении, это деление было асимметричным и сопровождалось образованием малой и крупной вакуолизированных клеток. Регенерация растений проходила путем эмбриогенеза, иногда имела место полиэмбриония, были получены фертильные растения. Яйцеклетки, для которых произошел акт слияния с частотой 6% вступали в деление при высоких концентрациях 2,4-дихлорфеноксиуксусной кислоты (25, 30 и 40 мг / л). В ходе описанных выше экспериментов были получены и другие варианты продуктов. Е. Kranz et al. [68] удалось провести электрослияние спермиев синергид, центральной клетки и изолированных яйцеклеток из протопласта мезофильных клеток. Получены также слияние ядер двух яйцеклеток. При делении продукта такого объединения наблюдали аномальный цитокинез, вызванный полярностью яйцеклетки. Индуцировано также клеточное деление после слияния яйцеклетки кукурузы со спермиями растений родов Colt. Sorghum, Hordeum и Triticum. Такие гетерологические продукты давали микрокаллусы. Кроме того, отмечено клеточное деление продуктов объединения яйцеклетки и протопласта диплоидной соматической клетки кукурузы [7].

Кариогамия в центральной клетке зародышевого мешка с образованием первичного ядра эндосперма in vitro проходила в течение 120 минут после слияния клеток. На начальных этапах эндосперм развивался по пути ценоцита, что соответствует ядерному типу развития, характерному для кукурузы. Через 3-5 дней наступало клеткообразование, дальнейшее развитие эндосперма in vitro в целом соответствовал таковому на растении [8].

Химический метод слияния гамет предложенный J. Faure et al. [64] и считается альтернативой электрослияния. Успех работы по этой методике составляет 97%. Изолированные спермии и яйцеклетки заключались в микрокапли среды, содержащей 5 мМ кальция, затем приводились в контакт стеклянными микроиглами. Е. Kranz et al. [5] получили многоклеточные структуры из зигот кукурузы, созданных химически индуцированным слиянием.

Еще одним возможным способом искусственного оплодотворения растений является микроинъекции сперматозоидов в женские клетки. Исследование окрашенных срезов показали, что мужские ядра появлялись в цитоплазме яйцеклетки или центральной клетки в 14% случаев, однако случаи контакта мужского и женского ядер были очень редкими [10].

Разработанная модель оплодотворения в искусственных условиях позволяет изучать экспрессию в период оплодотворения, раннего эмбриогенеза и эндоспермиогенеза как собственных генов [13], так и чужеродных. В целом для получения и изучения экспрессии чужеродных генов в гаметах и зиготах применяются два подхода [1]. Во-первых, это прямой перенос ДНК в эти клетки путем микроинъекций. Существенные преимущества использования яйцеклеток и зигот как мишеней для микроинъекций чужеродной ДНК были показаны в ряде публикаций. Считается, что в этом случае контроль за встраиванием можно осуществлять сразу же после микроинъекции в конкретной клетке, интересующий исследователя. Такой метод удобен для оценки активности промоторов в клетках-мишенях. Так после микроинъекций погруженных в агарозу зигот кукурузы с частотой 30% была получена транзиентная экспрессии гена gfp Aequorea Victoria, кодирующего синтез зеленого флюоресцирующего белка, под контролем 35S промотора [15]. N. Leduc et al. [9] получила транзиентную экспрессию после микроинъекций в зиготы кукурузы, изолированные через 24 часа после опыления, плазмидной ДНК, содержащей ген gus под контролем промотора Хинтона P3C4 кукурузы и двух регуляторных генов синтеза антоциана под контролем 35S промотора как репортерного. Транзиентная экспрессия репортерных генов наблюдалась в зиготах через 4 дня после инъекций с частотой 3,5%.

Система искусственного оплодотворения растений in vitro генетически трансформированных гамет и зигот позволяет изучать не только экспрессию трансгена в этих уникальных структурах, но и процессы транскрипции и трансляции в гаметах, зиготах, проэмбрио и молодых зародышах. Так, в исследованиях на мутантах было показано, что в период оплодотворения и раннего эмбриогенеза по-разному экспрессируются одни и те же гены, привнесенные женскими и мужскими гаметами. Даже успех развития зародыша и особенно эндосперма часто зависит от того, содержится ли тот или иной мутант аллель в яйцеклетке, центральной клетке или спермии [2]. К сожалению, сообщений о стабильной трансформации после микроинъекций в гаметы или зиготы кукурузы нет.

При втором подходе экспрессия трансгенов может быть изучена в гаметах и зиготах трансгенных растений, полученных после трансформации каллусной ткани. У трансгенной по гену gfp линии кукурузы, что дает яркую флюоресценцию в соматических клетках, данный ген экспрессируется в яйцеклетках, синергидах и центральных клетках, тогда как флюоресценция в трансгенных мужских гаметах не наблюдалось. При слиянии же нетрансгенных яйцеклеток с трансгенными спермиями транскрипция трансгена индуцировалась вскоре после оплодотворения и белок GFP детектировал в зиготах [15].

Список литературы

  1. Сатарова Т.Н. Искусственное оплодотворение у кукурузы и перспективы его использования // Вісник Дніпропетровського університету. Сер. Біологія. Екологія. – 2006. – №4. – С.172 – 176.
  2. Chaudhury A., Koltunow A., Payne T. etal. Control of early seed development // Ann. Rev. Cell. Dev. Biol. – 2001. – Vol.17. – P.677 – 699.
  3. Faure J.E., Digonnet C., Mol H., Matthys-Rochon E., Dumas C. In vitro pollination and fertilisation in maize (Zea mays L.): technical procedures and prospects for the dissection of the double fertilisation process // Plant Sci. – 1994. – V.104. – P.1 – 10.
  4. Guo F., Huang B.Q., Han Y., Zee S. Y. Fertilization in maize indeterminate gametophyte l mutant // Protoplasma. – 2004. – Vol.223. – P.111 – 120.
  5. Kranz E., Bautor J., Lörz H. In vitro fertilization of single isolated gametes of maize mediated by electrofusion // Sex. Plant Reprod. – 1991. – Vol.4. – P.12 – 16.
  6. Kranz E., Bautor J., Lörz H. In vitro fertilization with isolated, single gametes results in zygotic embryogenesis and fertile maize plants // Plant Cell. – 1993. – Vol.5. – P.739 – 746.
  7. Kranz E., Wiegen P., Lörz H. Early cytological events after induction of cell division in egg cells and zygote development following in vitro fertilization with angiosperm gametes // Plant J. – 1995. – Vol.9. – P.9 – 23.
  8. Kranz E., Wiegen P., Quarder H., Lörz H. Endosperm development after fusion of isolated, single maize sperm and central cells in vitro // Plant Cell. – 1998. – Vol.10. – P.511 – 542.
  9. Leduc N., Matthys-Rochon E., Rougier M. et al. Isolated maize zygotes mimic in vivo embryonic development and express microinjected genes when cultured in vitro // Dev. Biol. – 1996. – Vol.177. – P.190 – 203.
  10. Matthys-Rochon E., Mol R., Heizmann P., Dumas C. Isolation and microinjection of active sperm nuclei into egg cells and central cells of isolated maize embryo sacs // Zygote. – 1994. – V.2 – P.29 – 35.
  11. MengF., NiZ., Wu L., SunQ. Differential gene expression between cross-fertilized and self-fertilized kernels during theearlystagesof seed developmentinmaize// PlantScience(Oxford). – 2005. – Vol.168. – P.23 – 28.
  12. Okamoto T., Higuchi K., Shinkawa T. et al. Identification of major proteins in maize egg cells // Plant and Cell Physiology. – 2004. – Vol.45. – P.1406 – 1412.
  13. Okamoto T., Scholten S., Loerz H., Kranz E. Identification of genes that are up- or down-regulated in the apical or basal cell of maize two-celled embryos and monitoring their expression during zygote development by a cell manipulation and PCR-based approach // Plant and Cell Physiology. – 2005. – Vol.46. – P.332 – 338.
  14. Saze H., Scheid O. M., Paszkowski J. Maintenance of CpG methylation is essential for epigenetic inheritance during plant gametogenesis //Nature Genetics. – 2003. – Vol.34. – P.65 – 69.
  15. Scholten S., Kranz E. In vitro fertilization and expression of transgene in gametes and zygotes // Sex. Plant Reprod. – 2001. – Vol.14. – P.35 – 40.

Автор статьи и фото в статье: Ляпустина Е.В.

Добавить комментарий

CAPTCHA
Этот вопрос задается для того, чтобы выяснить, являетесь ли Вы человеком или представляете из себя автоматическую спам-рассылку.