Вы здесь

Методика цитоморфологических исследований Clematis vitalba L.

Средняя: 5 (1 оценка)
Окраска препаратов

Все цитоморфологические исследования проводились на давленых препаратах, приготовленных по стандартным методикам [7, 48, 129, 130]. Для проведения цитоморфологических исследований каллус фиксировали по Карнуа (в смеси этанол-ЛУК-хлороформ – 6:3:1 или этанол-ЛУК – 3:1) в течение 12-ти часов при комнатной температуре или 24-е часа при температуре 4-6 0С. Фиксированный материал промывали в 3-4-х порциях 70 %-го этилового спирта до исчезновения запаха уксусной кислоты и хранили в 70 %-ом растворе этанола.

Для окрашивания использовали 1 %-ный раствор ацетокармина (1-2 г кармина (Merck, Германия), растворяли при подогревании на водяной бане в колбе с обратным холодильником в течение 45-60-ти минут в смеси 45 мл ЛУК, 45 мл дистиллированной воды и 10 мл 96 % этанола. После остывания темно-красный раствор ацетокармина отфильтровывали и использовали для окрашивания препаратов); 0,2 % раствор метиленового голубого (200 мг красителя растворяли в 25 мл 96 % этанола, доводили дистиллированной водой до 100 мл) [148]. Для выявления запасного крахмала использовали раствор Люголя (250 мг I2, 750 мг KI в 50 мл воды), для выявления запасных липидов – насыщенный раствор судана-III в 70 % этаноле. В качестве красителей на общие белки использовали амидочерный-10Б.

Методика окрашивания:

  • ацетокармином: материал помещали на предметное стекло с лункой в каплю красителя. Подогревали до температуры 70 0С над пламенем спиртовки в течение 3-5-ти мин, при необходимости прибавляя краситель по каплям. Остатки красителя удаляли фильтровальной бумагой, окрашенный материал для дифференцировки и мацерации помещали в 90 % уксусную кислоту, нагревая еще 5-10 мин. После чего переносили на предметное стекло, заключали в каплю глицерина или смеси хлоралгидрат-вода-глицерин (5:2:1), накрывали покровным стеклом и раздавливали постукиванием обратной стороны препарировальной иглы до равномерного распределения клеток.
  • метиленовым голубым, раствором Люголя, суданом-III: материал помещали на предметное стекло в каплю красителя на 3-5 мин, после чего, удалив остатки красителя фильтровальной бумагой или смыванием дистиллированной водой, проводили раздавливание.

Исследование препаратов проводили на микроскопе МРI-5, с окуляром 10× и объективами 5×, 10×, 20×, 40× и 100×. Размеры клеток определяли при помощи шкалы окуляр-микрометра МОВ-1–15 и объект-микрометра ОМП (при увеличении 15×8).

Проведение микрофотосъемки осуществляли цифровой фотокамерой OlympusFE-190 (Olympus Imaging, США).

Метод тонкослойной хроматографии

Для химического анализа на содержание тритерпеновых гликозидов (ТГ) каллусы, находящиеся в стационарной фазе роста, извлекали из культуральных сосудов и высушивали при температуре 60 0С. Воздушно-сухую массу тщательно измельчали и экстрагировали 80 %-ным изопропиловым спиртом при температуре кипения изопропанола. Для выявления наличия ТГ использовали ТСХ-анализ, который проводили на пластинках «Silufol» («Kavalier», Чехословакия) [101, 180]. Для разделения ТГ на фракции использовали нейтральную систему растворителей хлороформ-метанол-вода (100:40:7). Детектирование пятен ТГ на хроматограммах осуществляли 10 %-ным спиртовым раствором фосфорновольфрамовой кислоты с добавлением 2 % пара-оксибензальдегида с последующим нагреванием хроматограмм при 100-105 0С. В качестве контроля использовали водно-спиртовые растворы экстрактов из листьев и корней C. vitalba.

При определении содержания ТГ в биомассе каллусов использовали показатель относительного содержания гликозидов (ОСГ), который рассчитывался (полуколичественно) по площади пятен фракций гликозидов после проявления хроматограмм. При этом за контроль (максимально возможное количество гликозидов в пробе) была принята концентрация ТГ в органах интактных растений.

Все полученные экспериментальные данные подвергались обработке с помощью методов статистического анализа [96, 133, 145].

В ходе выполнения исследований и при оформлении работы использовали следующее программное обеспечение: внутреннее приложение WindowsXP, пакет прикладных программ MicrosoftOffice, фотографии и рисунки обрабатывались при помощи пакета прикладных программ CorelDraw13.0.

Ссылки на литературу в тексте соответствуют источнику Индуцированный морфогенез in vitro и накопление тритерпеновых гликозидов в каллусных культурах ломоноса виноградолистного (Clematis vitalba L.)

Источник: Сидякин А.И., Индуцированный морфогенез in vitro и накопление тритерпеновых гликозидов в каллусных культурах ломоноса виноградолистного (Clematis vitalba L.): Дис. … канд. биол. наук. Симферополь. 2011. – 217 с.

Автор фото в статье: Ляпустина Е.В.

Материал любезно предоставил Сидякин Андрей Иванович – к.б.н., ас. каф. ботаники и физиологии растений и биотехнологий и м.н.с. Биотехнологического центра НИЧ Таврического национального университета им. В.И. Вернадского, научный консультант ООО КрымБио

Добавить комментарий

CAPTCHA
Этот вопрос задается для того, чтобы выяснить, являетесь ли Вы человеком или представляете из себя автоматическую спам-рассылку.