Ауксины – группа фитогормонов, которые поддерживают рост клетки растяжением, инициируют образование корней и адвентивных почек и могут влиять на добавочное формирование зародышей. Образующиеся в тканях ауксины играют большую роль в регуляции передвижения пластических веществ в растительном организме. Клетки, обогащенные ауксинами, обладают аттрагирующим свойством (Кефели, 1973). Кроме того, ауксины регулируют полярность в тканях и органах растений, где они могут находиться как в свободной форме, так и в виде различных комплексов. Ауксины могут образовывать соединения с белками и нуклеиновыми кислотами и в такой форме храниться или транспортироваться в растении. У двудольных растений апикальная меристема – главное место синтеза ауксинов. Доказано, что они активно образовываются в зародышах семян. Транспорт ауксинов в растении осуществляется в основном активно в базипетальном направлении, поэтому удаление апексов приводит к общему снижению их концентрации и временному замедлению ростовых процессов (Myciєнко, 2001; Мананков и др., 2002).
В последнее время вместо ИУК и зеатина часто используют их синтетические аналоги. Это обусловлено целым рядом причин. Суть главной из них заключается в следующем: в питательную среду добавляют оптимальное для развития каждой конкретной культуры соотношение фитогормонов; однако пассируемые ткани содержат какое-то количество эндогенных гормонов, вследствие чего в начальный период культивирования создается избыток регуляторов роста. Позднее, по мере инактивации регуляторов роста, концентрация их постепенно снижается и к концу культивирования становится ниже оптимальной. В связи с этим в любой культуре почти всегда отмечаются колебания концентраций регуляторов роста на протяжении периода культивирования, что негативно сказывается на скорости роста. Чем интенсивнее инактивируется гормон, тем выше амплитуда колебаний. Синтетические аналоги гормонов в растительных организмах инактивируются намного медленнее, что, соответственно, значительно сокращает амплитуду колебаний концентраций фитогормонов и положительно сказывается на росте культур растительных тканей in vitro.
Наиболее перспективными аналогами ауксина являются производные нафталиновой кислоты и фенола: а-нафтилуксусная, фенилуксусная, феноксиуксусная и другие кислоты.
Ауксины обычно используются в средах либо в комбинациях с цитокининами (на стадии мультипликации), либо без них (если необходимо укоренить растения). Раньше в качестве ауксина применяли в основном ИУК, позднее предпочтение стали отдавать НУК и 2,4-Д в концентрации 10-6-10-5 М.
Бета-Индолилуксусная кислота (ИУК, индолил-3-уксусная кислота; C10H9NO2) часто применяется для укоренения микрочеренков in vitro (в дальнейшем может угнетать корнеобразование). На свету нестабильна, поэтому ее надо хранить в темном месте. Используется в качестве эффектора при работе с культурами клеток и тканей значительно реже, чем синтетические ауксины. Объясняется это, возможно, тем, что такие культуры обычно сохраняют способность к образованию достаточных количеств эндогенной ИУК (Запрометов, 1981). ИУК в сочетании с гиббереллинами индуцирует митозы в тканях растений. Содержится во всех частях растения, особенно молодых. Наиболее интенсивно синтез ИУК происходит в апикальных меристемах и молодых листьях. На ювенильных этапах развития основным источником ИУК является эндосперм и семядоли, которые обеспечивают гормонами надземную и подземную части растения. ИУК – главный гормон растений и во многом именно она обусловливает апикальное доминирование и аттрагирующий эффект. Основной предшественник в растительных тканях – триптофан.
Бета-Индолилмасляная кислота (ИМК, индолил-3-масляная кислота; C12H13NO2) – еще один гормон укоренения, обычно используемый культиваторами. Может синтезироваться в растениях природным путем, однако существует и искусственный аналог. В составе сред структурно более устойчива, чем ИУК, поэтому предпочтительна для индукции корнеобразования in vitro (в дальнейшем может угнетать их формирование).
Альфа-Нафтилуксусная кислота (НУК, 1-нафтилуксусная кислота; C12H10O2) – очередной промотор корнеобразования, который часто используют для поддержания стабильного роста каллуса (дальше может угнетать корнеобразование).
2,4-Дихлорфеноксиуксусная кислота (2,4-Д; С8Н6Сl203) – также синтетический ауксин, который получил наибольшее распространение на практике. Обычно способствует делению клеток, тем самым поддерживая хороший рост культуры. Это соединение широко используется при размножении in vitro для инициации роста каллуса. Однако в некоторых случаях было отмечено ингибирующее действие 2,4-Д на образование тех или иных вторичных соединений в каллусах. Известно, что 2,4-Д разобщает процессы окислительного фосфорилирования и тем самым нарушает обеспечение митоза энергией. Следовательно, эти вещества препятствуют началу митоза, но не удвоению хромосом, т. е. митоз не наступает, но объем ядер увеличивается. Следует отметить, что во многих случаях важное значение имеет используемая концентрация 2,4-Д.
Дикамба (3,6-дихлор-2-метоксибензойная кислота; С8Н6С12О3) – синтетический регулятор роста типа ауксина, который используется как гербицид. В асептической культуре в основном применяют для инициации каллусообразования.
Цитокинины – вещества, которые стимулируют рост тканей посредством деления клеток, мультипликацию побегов и пролиферацию пазушных почек. Они помогают задерживать процессы старения растительных тканей и могут влиять на транспорт ауксинов.
Известно, что цитокинины способствуют увеличению размера листовой пластинки у этиолированных растений, стимулируют рост адвентивных почек и тем самым ослабляют эффект апикального доминирования (Мусиенко, 2005).
Добавление цитокининов к питательным средам способствует формированию более коротких побегов с крепкими стеблями, что может быть полезным в период перед высадкой в субстрат. Обычно вносятся в среды для укоренения.
Особенно четко проявляется потребность в цитокининах для образования каллуса при использовании ИУК. Когда же в среду вводят 2,4-Д, она резко уменьшается либо совсем исчезает (Witham, 1968). Однако в ряде случаев через несколько пассажей потребность в них может полностью исчезнуть. Вероятно, это связано с увеличением способности к синтезу растениями собственных цитокининов (Мананков и др., 2002).
Зеатин (C10H13N50) часто используют как альтернативу цитокининам типа 2-изопентиладенина (2-iP), бензиладенина (БА) или кинетина. Молекулярные структуры зеатина и кинетина сходны. Это производные аденина или аминопурина. Зеатин может существовать в растениях в цис- или транс-конфигурации; они обе физиологически активны, хотя в растениях преобладает последняя. Зеатин – доминирующий вид цитокининов в растительных тканях; равно как и другие цитокинины, может содержаться в растениях в форме рибозидов, риботидов или гликозидов, являющихся транспортной или запасной формой гормона.
6-Бензиламинопурин или бензиладенин; 6-бензиламинопурин (БАП; C12H11N5) используется чаще других цитокининов как промотор пробуждения пазушных почек. В культуру ткани вводится синтетическое соединение, хотя в норме это вещество содержится в растении, но его тяжело идентифицировать. Одна из форм 6-бензиламинопурина — рибозид (C17H19N5O4 — часто применяется как альтернатива БА. Во многих случаях наличие БАП необходимо для процессов клонального размножения, однако известно, что это препятствует нормальному корнеобразованию. Поэтому в работе часто практикуется промежуточное культивирование на средах со сниженной концентрацией БАП, после чего регенеранты переводят на среды для укоренения.
БПА, или ПБА (N-бензил-9-(2-тетрагодропиранил) аденин; C17H19N5О) – синтетический регулятор роста цитокининового типа, который иногда используют для увеличения объема каллусной массы или инициации пазушных почек.
2-iP (N6-(2-изопентил) аденин; C10H13N5) – обычный компонент прописей многих сред для культуры тканей высших растений. Инициирует активное деление клеток и их последующий нерегулируемый рост. Производится искусственно, однако первоначально был обнаружен в рибонуклеиновой кислоте и у некоторых штаммов Corynebacterium fasscians.
Кинетин (6-фурфуриламинопурин; C10H9N5O) – регулятор роста, который был выделен из ДНК. Часто используется в средах как промотор деления клеток (увеличивает частоту митозов в меристемах). В низких концентрациях это вещество сокращает продолжительность интерфазы (Робертис и др., 1973).
Гиббереллины – группа природных соединений. Они регулируют рост клеток растяжением и ответственны за рост (удлинение) стеблей растений. На сегодняшний день идентифицировано более 110 гиббереллинов. Некоторые из них содержатся в зародышах растений и инициируют превращение крахмала в более простые углеводы, стимулируют ряд ферментов. Иногда один из гиббереллинов – гибберелловую кислоту (ГК3) – используют в комплексе с ауксинами и цитокининами как регулятор роста в культуральных средах.
ГК3 подавляет образование антоцианов и лигнина, но не оказывает влияния на образование проантоцианидинов. Удлинение стеблей под действием гиббереллинов достигается вследствие резкой активации процессов деления и растяжения клеток интеркалярных меристем. Ауксины на этот процесс не влияют; в свою очередь, гиббереллины не действуют или оказывают слабое действие на рост изолированных междоузлий, сильно реагирующих на обработку ауксином.
Абсцизовая кислота (АБК) синтезируется во всех органах растения, хотя долгое время было распространено мнение, что она образуется преимущественно в хлоропластах. В клетках мезофилла биосинтез АБК осуществляется главным образом в цитозоле, но накапливается фитогормон в основном в хлоропластах. Концентрация активной формы АБК, так же, как и других гормонов, определяется процессами ее синтеза, метаболизма компартментации и транспорта. Угнетает рост и образование растворимых фенольных соединений и лигнина в клетках.
Выяснено, что АБК ответственна за подавление роста корней на свету и их геотропическую реакцию. Фитогормон обнаружен в корневом чехлике, который проявляет повышенную чувствительность и к свету, и к действию гравитации (Мусатенко, 2003).
Образование in vitro соматических эмбриоидов часто происходит с различными морфологическими нарушениями. В этом случае добавление в среду АБК нормализует эмбриогенез (Kamada et al., 1981). Основные пути инактивации АБК в растениях – окисление и конъюгирование с углеводами. В растительном организме АБК выступает как антагонист ИУК, цитокининов и гиббереллинов. Торможение роста, вызываемое АБК, сопровождается подавлением синтетических процессов и ускорением старения тканей (Медведев, 2004).
Ancymidol (C15H16N2О2) – коммерческий препарат, ретардант с цитокининовым эффектом, известный под названием A-Rest. Иногда его используют, чтобы сократить количество нежелательных боковых побегов или инициировать рост почек у некоторых культур.
Пара-хлорфеноксиуксусная кислота (С8Н7СlО3) – ауксиноподобный регулятор роста.
Этилен (С2Н4) – природное соединение, ненасыщенный углеводород, вырабатываемый растениями. Его предшественником является метионин. Этилен влияет на многие жизненно важные процессы в растительном организме (листопад, цветение, плодоношение). И хотя он не является компонентом сред, при культивировании в асептических условиях надо учитывать, что растения in vitro также активно его продуцируют; это может иметь нежелательные последствия в виде относительной замкнутости сосудовдля культивирования. Известно, что витрифицированные культуры выделяют значительно больше этилена (Kevers, Gaspar, 1985). Поскольку синтез этилена индуцируется в стрессовых условиях (in situ – критические температуры, патогены, засуха, аноксия; in vitro – длительные пассажи), его иногда называют стрессовым гормоном. Этилен способен угнетать процесс полярного транспорта ауксина и таким образом влиять на динамику содержания ауксинов в тканях.
Paclobutrazol (DL-1,2,4-триазол-3-аланин) – ретардант с цитокининовым эффектом; добавляется в культуральные среды на последней стадии выращивания для оптимизации адаптации пробирочных растений (Oliphant, 1990; Smith et al., 1992).
Phloroglucinol (1,3,5-триоксибензол), согласно данным некоторых авторов, обладает бактерицидными свойствами; может иногда поддерживать рост отдельных культур (Donnelly, Vidaver, 1988). Кроме того, может использоваться как антиоксидант (Smith, 1992) и при обработке витрифицированных растений (Phan et al., 1986).
TIBA (2,3,5-трийодобензойная кислота) может замедлять образование нежелательного каллуса и поддерживать рост некоторых культур; блокирует транспорт ауксинов в растительных тканях.
Фузикокцин – метаболит фитопатогенного гриба Fusicoccum amygdali Del., известен как регулятор роста растений. Это гликозид карботрициклического дитерпена с элементарной формулой С36Н56О12. Кроме основного соединения (фузикокцин А) гриб продуцирует ряд близких веществ, которые различаются степенью ацетилирования, положением ацетильных групп или меньшей степенью окисления агликоновой части молекулы (Мананков и др., 2002). Фузикокцин значительно стимулирует прорастание светочувствительных семян в темноте и рост зародышей, действуя на них более эффективно, чем гиббереллины и БА. Показана его способность полностью нейтрализовать ингибирующее действие на прорастание семян красного цвета видимого излучения, неблагоприятных температур и осмотического давления, а также АБК (Galli et al., 1975; Lado et al., 1975).
Источник: Биотехнология тропических и субтропических растений in vitro