При культивировании растительных тканей и клеток особое значение придается стерилизации инструментов и питательных сред. Стеклянную посуду подвергают воздействию сухого горячего воздуха или насыщенного водного пара. С этой целью применяют несколько вариантов стерилизации: посуду нагревают в сухожаровых шкафах до температуры 180°С (экспозиция 30 мин) или 160°С (экспозиция 60 мин) либо выдерживают при температуре 105°С в течение 4-5 ч. Кроме того, дополнительную стерилизацию посуда проходит и во время автоклавирования среды.
Стеклянную посуду, в которой была выявлена грибковая или бактериальная инфекция, следует сначала промыть в теплой воде с добавлением детергентов, а потом оставить на несколько часов, налив в нее хромовую смесь (хромпик). Последняя имеет сильно выраженные окислительные свойства. Вместо хромовой смеси можно использовать гидроксид натрия или кристаллическую соду. Затем посуду следует 6 раз прополоскать в проточной воде, 2 раза – в дистиллированной воде и поместить на 2 ч в сушильный шкаф при температуре 105°С.
Металлические инструменты, служащие для вычленения эксплантов и различных манипуляций с ними (лезвия, скальпели, пинцеты), а также стеклянные стаканы, чашки Петри перед обработкой нужно завернуть в бумагу и подвергнуть автоклавированию при давлении 2 атм и температуре 121°С в течение не менее 60 мин. После стерилизации все материалы следует хорошо высушить методом эжекции.
Существуют два основных способа стерилизации питательных сред – автоклавирование и фильтрование. В первом случае приготовленный раствор разливают в предварительно простерилизованную в сушильному шкафу посуду для культивирования, а затем стерилизуют в автоклаве при давлении 0,75–0,9 атм (температура 110-115°С) в течение 20-25 мин. Можно сначала методом автоклавирования простерилизовать большое количество среды в одном объеме, а затем в ламинарном боксе разлить ее в стерильную посуду для культивирования. Однако, на наш взгляд, последний вариант более трудоемок. Кроме того, при таком способе разлива среды увеличивается вероятность ее инфицирования. Подобная последовательность действий более приемлема при небольшом количестве среды.
Во втором случае используют стерильные фильтры Зейтца, Беркефельда, свечи Шамберлана, мембранные фильтры, незаменимые для приготовления сред с термолабильными компонентами (некоторые стимуляторы роста, витамины, антибиотики, аминокислоты, растительные экстракты), которые разрушаются при авто- клавировании. Фильтрация сред (холодная стерилизация) применяется также для приготовления смесей ферментов и выделения изолированных протопластов, сред с биологически активными компонентами, жидких сред.
Питательные среды, содержащие органические добавки, такие, как кокосовое молоко, картофельный отвар и пр., дезинфицируют путем фильтрования, используя специальные фильтры из диатомовой земли, плавленого стекла или сложных эфиров целлюлозы.
Однако полной стерилизации можно достичь лишь в процессе тиндализации, которую обычно проводят в аппарате Коха. Суть методики состоит в 2-3-кратном нагревании посуды водным паром до температуры 90-100°С с 24-часовыми интервалами. Первое нагревание приводит к уничтожению вегетативных форм, а последующие – к гибели микроорганизмов, которые образовались при температуре 25°С из склероция в перерывах между нагревами.
Тиндализацию также используют для стерилизации питательных сред, содержащих соединения, которые разрушаются при высоких температурах (например, гиббереллины инактивируются при температуре выше 90°С). То же относится и к сахарам, которые карамелизируются при высоких температурах.
Время термической дезинфекции зависит от объема посуды, в которую разлита питательная среда. Пробирки со средой стерилизуют 15 мин при температуре 115°С. Колбы, содержащие 100-500 мл питательной среды, дезинфицируют 30 мин при температуре 121°С и 45 мин при температуре 115°С. Колбы, в которых находится от 500 до 5000 мл питательной среды, стерилизуют в автоклаве в течение 35-40 мин при температуре 121°С и 50 мин при температуре 115°С.
Ф.Л. Калинин и соавт. (1992) рекомендуют следующую длительность стерилизации питательных сред в зависимости от их объема:
| Объем посуды, мл | Время стерилизации при 121°С (1 атм), мин |
|---|---|
| 20-50 | 15 |
| 75 | 20 |
| 250-500 | 25 |
| 1000 | 30 |
| 2000 | 40 |
После окончания стерилизации среды в камере автоклава нужно постепенно уменьшать давление и температуру. Крышку автоклава необходимо открывать только после того, когда стрелка манометра установится на отметке “0”. В противном случае, при резком изменении давления, среда может моментально закипеть, выплескиваясь из сосудов, в которых проводилась стерилизация, и смачивая крышки (это может привести к дополнительному инфицированию). В то же время нужно следить за тем, чтобы автоклав был разгерметизирован в момент установления стрелки манометра на отметке “0”; иначе крышку автоклава может засосать вследствие формирования градиента давлений. Если это произошло, нужно кратковременно (на 1,5-2 мин) включить тумблер автоклава, после чего крышку стерилизационной камеры можно без усилий открыть.
Посуду с питательной средой после стерилизации помещают в специальный шкаф для хранения готовых питательных сред и выдерживают в течение 3-5 суток для выявления грибковой или бактериальной инфекции.
Для закупоривания культуральных сосудов можно применять различные пробки. Сегодня распространена одноразовая пластиковая посуда, однако кроме нее в обиходе широко используют стандартные банки объемом 250 мл с жестяными крышками, колбы Эрленмейера (на 250 мл) и пр. В жестяных крышках проделывают отверстия диаметром 0,5-0,8 мм и вставляют в них поролоновые пробки (для вентиляции). Кроме того, это помогает устранить градиент давлений при стерилизации питательной среды. Если в работе используют ватно-марлевые пробки, их можно дополнительно защитить от проникновения инфекции колпачками из фольги. Алюминиевая фольга очень удобна в обращении и ее часто применяют; она обеспечивает достаточную вентиляцию культурального сосуда и в то же время препятствует быстрому высыханию питательной среды. Пробки из полиуретана, используемые для закрывания пробирок и колб, следует сначала вымыть в горячей воде с добавлением небольшого количества детергента, потом несколько раз прополоскать в водопроводной воде, затем – в дистиллированной. Сушат их при температуре 105°С в течение 2,5-3 ч. Подобной процедуре подвергают и крышки из алюминиевой фольги, предварительно проверив их целостность
Источник: Черевченко Т.М., Лаврентьева А.Н., Иванников Р.В. Биотехнология тропических и субтропических растений in vitro. – К.: Наук. думка, 2008. – 559 с.