Технология микроклонального размножения состоит из нескольких этапов. На первом этапе введения экспланта в культуру необходимо обеспечить его стерильность и приживаемость на питательной среде, так как от получения первичной культуры ткани зависит дальнейший успех клонирования.
При введении в культуру in vitro нужно стимулировать изолированный эксплант к дальнейшему развитию. Для этих целей чаще всего используют основные питательные среды – Мурашиге-Скуга (МС), Гамборга (В5) и их модификации, как правило, без внесения регуляторов роста. Добавление фитогормонов к средам для культивирования прежде всего зависит от вида растения, экспланта и сезона, в течение которого проводится изоляция. Требования к температуре и свету различны и определяются видом растения. Чаще всего используется интервал температур от 23 до 27°С, интенсивность освещения от 1000 до 3000 л к и 16- часовой фотопериод. Через 3-6 недель формируются единичные вторичные побеги или розетки почек, которые необходимо перенести на питательную среду для их дальнейшего размножения.
Цель второго этапа технологии микроклонального размножения – максимально быстрое увеличение количества полученных протокормов, каллусной массы, побегов, эмбриоидов или других структур. При размножении микроклонов необходимо стимулировать активно протекающие процессы дифференцировки вновь образуемых морфогенных структур. Обычно на этой стадии используют питательные среды того же состава, что и для первого этапа, изменяя лишь фитогормональный баланс.
Для достижения успеха на этом этапе технологии микроклонального размножения решающее значение имеет состав питательной среды, которая должна быть обогащена веществами, усиливающими процессы морфогенеза. Обычно используют среды Кнудсона, Мореля, МС, Андерсона, Линсмайера-Скуга (ЛС) с добавлением витаминов и регуляторов роста. Морфогенетическая реакция экспланта часто зависит от соотношения ауксинов и цитокининов в питательной среде. Высокие концентрации ауксинов способствуют образованию корней, но подавляют морфогенез побегов. Увеличение концентрации цитокининов активизирует появление побегов и угнетает корнеобразование. Сбалансированное соотношение этих веществ приводит к нормальному развитию растений.
При культивировании изолированных тканей очень часто наблюдается витрификация растений, вызванная инфильтрацией растительными тканями воды из атмосферы культурального сосуда или питательной среды. При каплусогенезе, по мере развития “основного” каллуса, проявления витрификации могут уменьшаться, так как на его поверхности образуется ткань, сходная с эпидермисом, которая препятствует проникновению жидкости. Как известно из литературы, устьица у культивируемых в асептических условиях растений остаются широко открытыми. Результаты электронно-микроскопических исследований показали, что стенки замыкающих клеток выглядят водянистыми и деструктурированными. В клетках устьиц, а иногда и в других клетках витрифицированных побегов, зафиксировано повышенное количество крахмала и липидных капель. Это, возможно, связано с усиленным снабжением сахарозой из питательной среды (Коshuchowa, 1988).
Полученные в культуре in vitro почки необходимо отделять друг от друга и по одной переносить на свежую питательную среду. Если каждая почка в продолжение 1 мес дает примерно 5 новых почек, то через год, в зависимости от вида растений, их количество может составить несколько сотен тысяч. В этой фазе возможны некоторые нежелательные изменения, связанные с поздним проявлением бактериального заражения исходного экспланта, что может неблагоприятно отразиться на конечном результате клонального размножения. Поэтому тестирование исходных эксплантов на наличие инфекции, а также обработка почек разными антибиотиками – необходимые и эффективные приемы.
Условия третьего этапа технологии микроклонального размножения должны соответствовать специальным физиологическим потребностям размножаемых видов. Растения- регенеранты необходимо подготовить к пересадке в субстрат. Укоренение вновь образованных in vitro побегов связано с индуцированием адвентивных корней. К этой фазе переходят тогда, когда получено достаточное количество побегов. Степень укоренения зависит от вида и сорта клонируемых растений, а также от продолжительности пассивирования in vitro и длительности культивирования при последнем пассаже.
При укоренении некоторых трудноукореняющихся видов растений эффективными могут быть такие фенольные соединения, как флороглюцин, хлорогеновая кислота, кверцетин, рутин и флоридзин.
В отличие от культуральной среды, используемой для размножения, концентрация минеральных солей и сахарозы в среде для укоренения уменьшается вдвое, цитокинины отсутствуют, а концентрация ауксинов увеличивается. Обычно на этом этапе повышают интенсивность освещения до 5000-8000 лк и фотопериод до 14-16 ч. Температурный режим должен коррелировать с условиями естественного произрастания.
Для укоренения используют как жидкие, так и твердые питательные среды. К недостаткам первых можно отнести необходимость использования подложки для удержания побега в вертикальном положении. Кроме того, в жидкой питательной среде образуются хрупкие корни, что усложняет процесс пересадки растений-ре генерантов.
Для оптимальной стимуляции корнеобразования можно применять кратковременное субкультивирование на средах, содержащих ауксины, после чего растения пересаживаются на среды, не содержащие гормоны, или непосредственно в субстрат. Многие авторы рекомендуют проводить процесс инициации корнеобразования в темноте, объясняя это усилением поглощения регуляторов роста в подобных условиях.
На этапе укоренения используют менее богатые среды, в том числе разбавленные. Иногда укоренение можно осуществить и в нестерильных условиях, однако в этом случае необходимо поддерживать высокую атмосферную влажность в теплице или камере, где происходит укоренение микроклонов.
Приведенные выше данные свидетельствуют о том, что несмотря на зависимость интенсивности ризогенеза от комплекса различных факторов, процессом укоренения in vitro можно успешно управлять. Вместе с тем достаточно большое количество циклов размножения, по-видимому, не всегда благоприятно. У некоторых ягодных культур, например у земляники, через несколько циклов размножения возникают так называемые пассивные почки, не способные к дальнейшему производству боковых почек и корнеобразованию (Попов, Высоцкий, 1978). Оптимальным надо, по-видимому, считать чередование двух-трех циклов размножения с циклом укоренения.
Источник: Черевченко Т.М., Лаврентьева А.Н., Иванников Р.В. Биотехнология тропических и субтропических растений in vitro. – К.: Наук. думка, 2008. – 559 с.