Вы здесь

Вторичный метаболизм культивируемых клеток высших растений

Средняя: 5 (1 оценка)
Культивирование растительных клеток

Вторичный метаболизм культивируемых клеток высших растений привлекает все большее внимание исследователей. Это обусловлено, прежде всего, перспективностью промышленного использования культивируемых клеток растений для получения соединений вторичного обмена растений [113, 121, 199, 211, 226]. Особую актуальность этот вопрос приобретает в связи с ухудшением экологической обстановки. По данным литературы, только в медицинской практике около трети всех применяемых лекарственных средств содержит вещества растительного происхождения [110]. Если также учитывать возрастающие потребности пищевой, косметической и сельскохозяйственной промышленностей, то становится очевидным необходимость замены растительного дикорастущего сырья, добываемого традиционным способом, на гарантированно получаемую биомассу культивируемых клеток, содержащую определенные соединения в достаточном количестве.

Первое сообщение о синтезе каучука появилось в 40-х годах 20-го столетия [59]. Однако многолетние исследования вопросов синтеза вторичных веществ в культуре тканей не дали ответа на вопрос: возможна-ли разработка единой общей стратегии управления синтезом вторичных веществ или в культуре тканей необходима стратегия индивидуальная для каждого конкретного случая. За время изучения синтеза вторичных метаболитов в культуре клеток растений накопился большой объем информации, на основе которой можно выделить следующий ряд закономерностей:

  1. культивируемыми клетками растений могут быть синтезированы практически все классы соединений вторичного обмена. К концу 70-х годов было известно уже более 100 соединений, обнаруженных в культуре клеток [89, 167];
  2. первичные культуры клеток часто содержат лишь незначительные количества соединений вторичного обмена или не содержат их вовсе. Однако, количество этих соединений можно значительно повысить путем оптимизации среды культивирования, клонирования, мутагенеза и скрининга [8, 9, 21];
  3. до сих пор не удается получить в культуре вещества, имеющие сложную структуру, поскольку, чем сложнее вещество и чем больше специфических этапов его синтеза после отделения от основного пути первичного метаболизма, тем менее вероятен синтез его в культуре [85, 90];
  4. накопление производных вторичного метаболизма приурочено к определенной фазе роста клеточной культуры. Чаще всего накопление идет в стационарной фазе роста каллусной или клеточной культуры [89, 107, 113, 115, 140, 207];
  5. в ряде случаев синтез вторичных соединений начинается только при появлении в клеточной культуре дифференцированных структур [8, 12, 20, 25, 69, 86, 90, 107, 115];
  6. стабильность и спектр синтезируемых веществ неодинаков. Может наблюдаться временная нестабильность синтеза (для некоторых стероидных гликозидов), также показана способность клеток в культуре синтезировать вещества, нехарактерные для интактного растения, например, в культуре тканей Cryptocarpa chinensis L. впервые выделена N-мето соль кариахина, которая в интактных растениях не встречается [194]. Вместе с этим в культурах клеток обнаруживаются вещества, характерные для ювенильных растений [113-115].

Обобщая данные научной литературы, можно предположить, что для получения каллусных и суспензионных культур-сверхпродуцентов веществ вторичного метаболизма растений в условиях in vitro необходимым условием является соблюдение определенной схемы.

Выбор вида растения. Данный пункт схемы подразумевает отбор при введении в культуру in vitro тех видов, в которых содержание конкретного метаболита будет изначально выше, чем в других сходных по составу видах растений [21].

Отбор генотипа исходного растения. Классическим примером важности этого этапа является эксперимент по получению культур Catharanthus roseus с высоким содержанием алкалоидов серпентина и аймалицина, проведенный M. N. Zenk'ом с сотрудниками [245]. Для этого ученые использовали 184 образца семян из различных мест произрастания. Из полученных проростков отобрали наиболее перспективные (богатые алкалоидами) и получили из них каллусные культуры. Каллусы перевели в суспензионные культуры клеток. Последние пересадили на агаризованные среды из большого количества колоний, выполнив огромное количество аналитических операций, отобрали самые лучшие для возврата к суспензионным культурам. Эти суспензионные культуры сохранялись на средах, максимально благоприятных для роста клеток. Для получения алкалоидов их пересевали на другую среду, которая способствовала их максимальному образованию. В результате работы были получены два штамма клеток. Один из них синтезировал большое количество одного серпентина (162 мг/л), второй – меньшее количество серпентина (77 мг/л), но зато очень много аймалицина (264 мг/л). При этом образование серпентина в исходных культурах не превышало 10 мг/л. Подобными методами, в концу 70-х годов, были получены более 16 культур клеток-сверхпроизводителей вторичных метаболитов, относящихся к более чем 10 классам соединений [167].

Эпигенетика экспланта. Очень часто в культуре тканей проявляются признаки эпигенетического характера. К эпигенетическим признакам относятся те проявления в метаболизме свободно живущей клетки in vitro, которые передаются в ряду клеточных поколений и которые связанные с клеточной дифференцировкой, как реализацией тотипотентности меристематической клетки при образовании органов и тканей [8, 9 20, 37, 49, 59, 73, 86, 89, 90, 107]. В ряде случаев клеточные культуры синтезируют вещества характерные для ткани экспланта. Например, культура клеток подофилла, полученная из корня растения, содержала подофиллотоксин, тогда как в культуре клеток стеблевого происхождения он отсутствовал [204]. Содержание диосгенина в культуре полученной из корневищ Dioscorea sp., Dioscorea composita Hemls., и D. tokoro Makino., был на порядок выше, чем в культуре полученной из побегов [26, 27, 218, 244]. Подобная зависимость прослеживается в культурах N. tabacum и Catharanthus roseus [188, 190, 242, 245, 246, 200]. Однако в культуре клеток и тканей, независимо от их эпигенома чаще всего проявляется тотипотентность клеток [21]. Так по данным А. С. Воробьева [26] клеточная культура Dioscorea deltoidea содержит два фуростаноловых гликозида – протодиосцин, характерный для листа, и дельтозид, характерный для корневища интактного растения [32]. По данным Р. Г. Бутенко и А. Г. Воллосовича культура клеток раувольфии змеиной стеблевого происхождения содержит как основой алкалоид стебля серпентин, так и аймалицин, находящийся в корне интактного растения [30].

Различные манипуляции с культурой in vitro. Культуры клеток растений характеризуются высокой гетерогенностью клеток в популяции [89, 90, 150, 168, 193, 206]. При этом гетерогенность наблюдается на разных уровнях организации генома клетки [91, 92]. Изменения генома клетки происходят на различных уровнях – на уровне точковых мутаций, хромосомных перестроек, наборов хромосом и, наконец, цитоплазматических генов. В качестве основных причин гетерогенности выдвигаются следующие предположения: а) гетерогенность генетической информации в эксплантах, б) мутационный эффект компонентов питательной среды, в) отсутствие корреляционных связей и контроля со стороны целого организма [89, 90, 168]. Гетерогенность позволяет с помощью клонирования отбирать клеточные линии и клеточные штаммы с сильно измененными основными свойствами, в частности, с повышенным синтезом вторичных соединений. При этом накопление спонтанных мутаций (сомаклональной изменчивости клеток) в ходе культивирования постепенно приводит к доминированию мутантных форм клеток над немутантными, особенно если это связанно с более высокими темпами роста сомаклонов. Таким способом, путем направленного и ненаправленного отбора были отобраны штаммы-продуценты шиконина, аймалицина, серпентина, берберина [196, 226, 238, 245, 247]. Однако, по данным литературы, при длительном культивировании часто происходит накопление новых мутаций, которые могут значительно снизить выход необходимого продукта [4, 8, 9]. Значительные изменения генома отмечены при использовании методов индуцированного мутагенеза и воздействия селективных факторов. В этом случае в полученных мутантных штаммах отмечается склонность к усиленному синтезу вторичных метаболитов [132, 150]. При применении химических мутагенов в работе с культурой Dioscorea deltoidea были получены несколько штаммов с более высокими скоростями роста биомассы и повышенным выходом стероидных гликозидов, спектр и количество которых значительно отличались от исходной линии [65, 66]. При использовании в качестве действующего селективного фактора на культуру клеток раувольфии 5-метилтриптофана на фоне гибели большинства клеточных агрегатов удалось получить устойчивые к этому веществу жизнеспособные штаммы. Полученные штаммы синтезировали больше основных алкалоидов, чем исходные культуры [94]. При обработке культуры клеток Acer pseudoplatanus п-фторфенилаланином были получены штаммы, которые синтезировали либо очень большие количества фенилаланина, либо очень высокие количества фенольных соединений [59]. При обработке культуры диоскореи N-нитрозо-N-метилмочевиной с использованием в качестве селективного фактора 25-оксихолестерина получены культуры сверх-продуценты стероидов [21, 65, 89].

Автор фото в статье: Ляпустина Е.В.

Ссылки на литературу в тексте соответствуют источнику.

Источник: Сидякин А.И., Индуцированный морфогенез in vitro и накопление тритерпеновых гликозидов в каллусных культурах ломоноса виноградолистного (Clematis vitalba L.): Дис. … канд. биол. наук. Симферополь. 2011. – 217 с.

Материал любезно предоставил Сидякин Андрей Иванович – к.б.н., ас. каф. ботаники и физиологии растений и биотехнологий и м.н.с. Биотехнологического центра НИЧ Таврического национального университета им. В.И. Вернадского, научный консультант ООО КрымБио

Добавить комментарий

CAPTCHA
Этот вопрос задается для того, чтобы выяснить, являетесь ли Вы человеком или представляете из себя автоматическую спам-рассылку.