На протяжении всей жизни растение сохраняет участки меристематических тканей, которые постоянно обновляются и способны давать начало организованным структурам – почкам, корням, эмбриоидам и целым растениям. Теоретически каждая соматическая клетка тотипотентна, т. е. при условии выполнения некоего комплекса условий она способна к регенерации и воспроизведению материнского растения. Однако на сегодняшний день наука располагает недостаточным объемом сведений о комплексе физических, трофических и гормональных факторов, необходимых для реализации генетической информации клеток многих видов в условиях культуры in vitro. Некоторые исследователи полагают, что проявление тотипотентности ограничивается только небольшим количеством морфогенно компетентных (меристемоидных) клеток, которые могут давать начало различным органам. Для получения изолированных культур отдельных групп растений лучше использовать разные органы. Например, для получения культуры Anthurium andreanum Lindl. удобно вычленять сегменты листовой пластинки, а для Chrysanthemum L. оптимальным первичным эксплантом являются сегменты цветоложа.
Не существует единого мнения о длине побегов, из которых изолируют меристемы. К примеру, одни авторы (Arditti, 1977) получали хорошие результаты, используя побеги Cymbidium Sw. длиной 3-5 см, другие (Morel, 1964) – побеги, только начинающие расти (длиной 1 см). Вероятно, отсутствует прямая зависимость между длиной побега-донора, из которого будет извлечена меристема, и успехом в целом. Следует учитывать, что у растений, имеющих симподиальный тип нарастания, терминальная меристема прекращает развитие на ранних стадиях, поэтому рекомендуется использовать очень молодые побеги высотой 5–7 см. Такие побеги содержат кроме апекса много латеральных почек у основания каждого листа.
У орхидных ценным исходным материалом для изоляции эксплантов служат зеленые вегетирующие туберидии. В зависимости от возраста и вида растений туберидии имеют 6–17 вегетирующих листьев, в пазухах которых расположены почки. На плагиотропной части корневища такого растения есть также почки возобновления, которые с успехом могут быть использованы для культивирования.
Известно, что у некоторых видов ткани генеративного происхождения имеют более высокий морфогенетический потенциал по сравнению с тканями вегетативного происхождения. При сопоставлении морфогенетической способности каллусов, полученных из тканей семени, листа, стебля и пыльника, было обнаружено, что наивысшей морфогенетической способностью обладают каллусы, образовавшиеся из пыльников. Более того, ткани одного и того же органа могут проявлять разную способность к морфогенезу. При проведении опытов с разными частями листа Bryophyllum daigremonthianum (Hamet et H.Perrier) Berger, на изолированных верхнем и нижнем эпидермисе и мезофилле определяли способность этих эксплантов к каллусообразованию и морфогенезу. Установлено, что каллус образовывался только на целостных эксплантах листа, а также на изолированном нижнем эпидермисе. Верхний эпидермис формировал лишь незначительный каллус. Изолированный мезофилл каллус не образовывал. Морфогенез с формированием стеблевых почек имел место только на каллусе из нижнего эпидермиса (Дмитриева, 1981).
В исследованиях, выполненных на тканях 2 видов плюша (Hedera L.), обнаружено, что на протяжении более чем 2 лет сохранялись морфологические особенности каллусов, для которых исходными эксплантами служили фрагменты стеблей на разных стадиях развития растений. Подобный феномен продемонстрирован и в экспериментах с различными представителями цитрусовых.
Существует и другое мнение, указывающее на поддержание или сохранение определенной исходной дифференциации в процессе культивирования. Это исследования по изучению первоначальной дифференциации в культивируемых клетках, проведенные A.Л. Курсановым и соавт. (1976), в которых на культурах ткани корнеплода Beta vulgaris L. при культивировании in vitro обнаружено частичное сохранение специфики углеводного обмена, свойственной исходному экспланту. В работе С.И. Мишарина и соавт. (1977) показано, что в процессе культивирования не исчезают белки, типичные для исходных тканей.
Исследования P. Lazzeri и соавт. (1986) были направлены на изучение влияния различных физических факторов и состава среды на рост in vitro эксплантов листьев, гипокотилей и корней представителей Brassica oleracea. Вначале экспланты культивировали при температуре от 4 до 40°С в течение 3-7 сут перед переносом в стандартные условия. Установлено увеличение количества выживших эксплантов, имеющих большие размеры. Листовые диски размером 7 мм формировали на порядок больше побегов, чем диски размером 4 мм. Отмечено увеличение количества образовавшихся побегов при высокой освещенности (1000 лк). Экспланты корней также формировали больше побегов в данных условиях. Для эксплантов всех типов наилучшие результаты получены при освещении белым светом. Предварительное культивирование эксплантов при разной температуре не оказывало достоверного влияния на их регенерационные способности.
Некоторые авторы изучали влияние регуляторов роста на разные экспланты табака. Установлено, что экспланты листьев образовывали значительное количество стеблевых почек на среде с добавлением кинетина. На стеблевых сегментах больше всего почек было при использовании среды с кинетином и 1-нафтилуксусной кислотой (НУК). Гиббереллин оказывал стимулирующее воздействие исключительно на экспланты листового происхождения (Cohen, 1986).
Дифференциация в тканях первичного экспланта отражается и на отдельных механизмах процесса вторичной дифференциации in vitro. Общеизвестно, что перед данным процессом каллусные клетки должны пройти серию делений. Это наблюдалось и при органогенезе в каллусе табака, и при создании эмбриогенного агрегата в культуре клеток моркови (Reinert et al., 1971). Очевидно, необходимы предшествующие клеточные деления, играющие регуляторную роль в определении пути развития, по которому будет идти редифференцирующаяся клетка.
С учетом сказанного выше чрезвычайно важно учитывать первоначальную дифференциацию в тканях исходного экспланта, поскольку она теснейшим образом связана с морфогенетической способностью тканей. Более того, специфика происхождения отдельной группы клеток сохраняется при длительном культивировании.
Однако общей закономерностью для культивируемых in vitro тканей остается возрастание цитогенетической вариабельности в процессе культивирования, что, в свою очередь, зачастую связано с потерей морфогенетического потенциала (Кунах, 2005).
Источник: Черевченко Т.М., Лаврентьева А.Н., Иванников Р.В. Биотехнология тропических и субтропических растений in vitro. – К.: Наук. думка, 2008. – 559 с.