Искусственное оплодотворение, генетическая трансформация и культивирование зиготы растений – как продукта слияния изолированных гамет
Искусственное оплодотворение открывает широкие перспективы для анализа процессов активизации яйцеклетки и развития зиготы, первичных клеток эндосперма и молодых проембрио, способствует изучению процессов, происходящих на клеточном уровне в момент и первое времена после оплодотворения, дает возможность получения зигот из гамет различных культурных сортов растений (Сатарова, 2006; Kranz, 2008). Процесс оплодотворения in vitro включает три последовательные этапы: изоляция, обработка женских и мужских гамет, слияние пар гамет, культивирование одной клетки (оплодотворенной яйцеклетки – зиготы, или оплодотворенной центральной клетки – первичной клетки эндосперма) (Kranz, 2008). Техника искусственного оплодотворения предусматривает электрослияние гамет (Kranz, 1991, 1993; Kovak, 1995; Kumlehn, 1996), слияние гамет химическим методом (Faure, 1994), микроинъекции спермиев в женские клетки (Matthys-Rochon, 1994). Лучшим методом считается электрослияние, химический метод является альтернативой, однако имеет свои недостатки и нуждается в оптимизации для повышения эффективности (Сатарова, 2006; Kranz, 2008). Использование химического метода слияния внесло вклад в установление важного факта, а именно повышение уровня Ca2+ во время оплодотворения (Antoine, 2001) и может помочь при понимании процесса слияния изолированных гамет в искусственных условиях и оплодотворения вообще (Kranz, 2008). Установлено, что для эффективного слияния клеток тургор гамет должно быть на высоком уровне (Uchiumi, 2007). Микроинъекции спермиев в женские клетки имели не большой успех, из-за низкой частоты контакта мужского и женского ядер (Matthys-Rochon, 1994).
Расширение генетической базы растений позволит получать растения с заданными свойствами. Введение генетического материала непосредственно в клетки растения лишает необходимости искусственного скрещивания гамет. Изолированные зародышевые мешки, яйцеклетки и клетки спермиев наиболее подходящие клетки для генетических манипуляций. Введение трансгенов в одну или обе гаметы до оплодотворения, или вблизи их во время оплодотворения вызовет стабильную трансформацию (Leduc, 1996). Присутствие меньшего количества клеток во время таких манипуляций уменьшает возможность получения неправильных растений. Микроинекция, частичное бомбордирование или субкультивувание с Agrobacterium tumefaciens также могут быть использованы для ввода трансгенов в изолированные зародышевые мешки (Songstad, 1995). Большинство существующих методов создания трансгенных растений предусматривают промежуточную стадию каллуса, однако предотвращение калусообразования важно для получения растения. Процессы происходящие при пролиферации каллуса являются неблагоприятными для воспроизведения растений. Преимущество все больше наддается зиготическому эмбриогенезу.
Культура зигот, основанная на эмбриогенезе in vitro может быть полезной для генетической трансформации (He, 2004; Kranz, 2008). Это сочетание открывает широкие перспективы в изучении процессов репродукции растений. Доращивание зигот, полученных после електрослияния женских и мужских гамет in vitro или после микроинъекций генов в зиготу достигнуто у кукурузы (Kranz, 2008; Leduc, 1996), ячменя (Holm, 2000) и риса (Uchiumi, 2006). У пшеницы регенерация зиготы, после електрослияния гамет дала микрокаллусы (Kovak, 1995; Kumlehn, 1996). Во время культивирования после микроинъекций применяли субкультивувание (клетки – медсестры). Зигота и первичные клетки эндосперма, полученные путем електрослияния способны развиваться независимо. Поэтому технология искусственного оплодотворения является уникальной образцовой системой для исследований ранних стадий эмбриогенеза и ендоспермиогенеза. Зиготичный эмбриогенез кукурузы было получено без сопроводительных тканей материнского организма и тканей эндосперма (Kranz, 2008). До сих пор удовлетворительных результатов для получения развития после оплодотворения в пробирке так и не получен в двудольных растений. Это может быть связано с малыми размерами клеток гамет различных двудольных растений и с тем, что стадии цикла клеток изолированных мужских и женских гамет не совпадают и они не способны активизировать зиготичное ядро и процессы деления клетки. Это подтверждается для табака и Arabidopsis (Tian, 2005; Friedman, 1999).
Исследования показывают, что сочетание культуры зигот с генетической трансформацией предлагает перспективную технику для генетического анализа эмбриогенеза и развития зерновых растений, в том числе злаков. Метод культивирования зигот, полученных путем искусственного опыления является средством получения зиготичных зародышей и растений из изолированных гамет после оплодотворения in vitro.
Автор статьи и первого фото в статье (зародышевый мешок кукурузы, содержащий зиготу): Ляпустина Е.В.
Автор второго и третьего фото в статье: Сатарова Т.Н.