Важным фактором, влияющим на успешность размножения того или иного вида растений, является питательная среда, которая должна содержать сбалансированный состав макро- и микроэлементов, углеводов, витаминов, регуляторов роста, аминокислот. Для успешного размножения in vitro в большинстве случаев прописи сред приходится подбирать индивидуально для каждого вида и даже сорта или культивара различных растений.
Некоторые среды, рекомендуемые в литературе, содержат много компонентов, другие более просты. В прописи сред многие авторы включают вещества неопределенного состава: пептон, гидролизат казеина, дрожжевой автолизат, картофельный экстракт, растительные соки, эндосперм кокосового ореха, гомогенат плодовбанана и т. д.
Среды могут быть авизированными или жидкими. К примеру, для пролиферации новообразований и их роста удобнее использовать жидкие среды, прорастание семян и органогенез лучше происходят на твердых питательных средах.
Ткани, выращиваемые в жидких питательных средах, обычно культивируют в роллерах с круговым перемешиванием среды или в шейкерах вибрирующего типа, иногда используют стационарную среду, помещая ткань на мостики из фильтровальной бумаги.
Химический состав среды, ее физические свойства должны соответствовать задачам, поставленным на данном этапе исследования. Основные задачи, которые решает исследователь при размножении растений в асептических условиях, можно сформулировать так: ввести в культуру, размножить (этап мультипликации), укоренить, высадить ex situ с последующей постасептической адаптацией. В соответствии с задачами процесс клонального размножения принято условно разделять на соответствующие этапы.
- На первом этапе часто в состав сред вводят антиоксиданты, предупреждающие активацию гидролитических ферментов и гибель высаженных эксплантов.
- На втором этапе состав среды преимущественно такой же, однако во многих случаях ее обогащают веществами, которые вызывают и многократно усиливают формообразовательные процессы, применяя увеличенные концентрации цитокининов.
- На третьем этапе подбирается состав среды, способствующий укоренению регенерантов; она или вообще не содержит фитогормонов, или содержит лишь небольшие количества ауксинов.
Успех клонального размножения во многом зависит от наличия и концентрации в среде тех или иных элементов минерального питания, органических соединений. Ошибки, допущенные при составлении прописей или в процессе непосредственного приготовления питательных растворов, во многих случаях очень наглядно проявляются на культивируемых растениях (формообразовательные процессы, ритмы развития).
Необходимо четко представлять, из какой климатической зоны происходит растение, знать его биологию и особенности размножения. Сегодня широко известен целый ряд готовых базовых питательных сред для всех этапов микроразмножения растений, однако предпочтительнее индивидуальное покомпонентное приготовление каждого типа питательной среды. Во-первых, это намного дешевле, во-вторых, позволяет своевременно и оперативно реагировать на изменения в поведении культуры in vitro.
Состав питательных средявляется важным фактором, влияющим на рост и развитие растений in vitro. Кроме основных макроэлементов в состав большинства питательных сред входят также и микроэлементы; определенное их количество вносится вместе с макроэлементами. Для приготовления среды отмеривают нужное количество каждого солевого раствора, взвешивают соли железа, сахарозу, вносят те или иные добавки.
При необходимости питательные среды готовят на дистиллированной или бидистиллированной воде. Для удобства в работе и ускорения процесса целесообразно заранее приготовить растворы макро- и микроэлементов, соответственно в 10 и в 100 раз превышающие концентрацию рабочих растворов. Маточные растворы солей хранят в холодильнике при температуре 2-4°С в емкостях из темного стекла не более 6 недель.
Растворы регуляторов роста и витаминов обычно готовят из расчета 1 мг вещества на 1 мл раствора. Цитокинины (6-бензиламинопурин (БАП), зеатин, кинетин) сначала растворяют в не большом количестве 1 н щелочи, ауксины (ИУК, 1-нафтилуксусная кислота (НУК), 2,4-дихлорфеноксиуксусная кислота (2,4-Д)) – в 1 капле этанола и затем доводят до нужного объема бидистиллированной водой. Растворы витаминов и фитогормонов также хранят в холодильнике, однако для лучшей сохранности их можно разливать в емкости (эпендорфы) по 3-5 мл (для разового использования) и хранить в морозильной камере. Кинетин плохо растворим. С этой целью можно использовать различные растворители: 1 М раствор НС1 (несколько капель), 50%-й раствор этанола, диметилсульфат или 2%-й раствор NaOH. Гиббереллины растворяют в теплой дистиллированной воде. При этом следует помнить, что эти соединения термонестабильны.
Гумат натрия, гидролизат казеина, дрожжевой автолизат готовят в день их использования.
Агар лучше расплавить непосредственно перед употреблением в половинном объеме бидистиллированной воды, а затем добавлять к среде.
С учетом того что в растворах катионы простых неорганических солей железа, взаимодействуя с гидроксильными группами, могут выпадать в осадок (Fe203 • 3Н20) и плохо растворяются в средах, pH которых 5,0, железо в прописи питательных сред вводят в виде особых комплексных соединений — хелатов (NaFeЭДТА, FeЭДТА).
Приготовление растворов железа требует особенной тщательности. Раствор NaFeЭДТА готовится в следующей очередности: на аналитических весах взвешивают 5,57 г FeS04 • 7Н20 и 7,45 г NaFeЭДТА. Далее в мерную колбу емкостью 1 л высыпают навески и объем доводят до метки. Раствор FeЭДТА готовят так: 26,1 г этилендиаминтетрауксусной (ЭДТА) кислоты нужно растворить в 268 мл 1 М раствора КОН, после чего добавить 24,9 г FeS04 х 7Н20 и довести объем дистиллированной водой до 1 л. Полученный раствор необходимо аэрировать в течение нескольких последующих часов с целью окисления (Grabowski et al., 1987).
Все манипуляции по приготовлению растворов удобно проводить с помощью магнитной мешалки. Дистиллированная вода должна быть теплой (37-40°С). Полученные таким образом маточные растворы являются комплексными соединениями железа, из которых по мере надобности берут необходимый объем, в зависимости от состава питательной среды. Растворы железа, как и все остальные растворы, должны храниться в холодильнике.
Наиболее часто используются среды с показателем pH от 4,3 до 6,0, т. е. в кислом диапазоне. Иногда, при длительном культивировании некоторых видов, со временем может произойти закисление культуральной среды, что негативно влияет на темпы роста. В этом случае необходимо проверить кислотность отработанной среды, и если сдвиг действительно произошел, то нужно чаще проводить пассажи.
Для коррекции кислотности используются 1 н растворы гидроксида натрия (NaOH) и соляной кислоты (НСl). Корректировку проводят перед автоклавированием во время активного перемешивания среды на магнитной мешалке, постоянно контролируя значения pH и при необходимости добавляя по каплям указанные выше растворы. Корректируя pH, нужно несколько завышать кислотность сред, так как во время автоклавирования происходит небольшой сдвиг pH в кислую сторону (~ на 0,5) вследствие образования сахарных кислот.
Источник: Биотехнология тропических и субтропических растений in vitro