Методы определения сахаров

Опубликовано: 12 августа 2016 | Статьи по биотехнологии

Метод определения моносахаридов по Лисицыну Д. Н. и метод определения сахаров Макена и Шоорля

Метод определения моносахаридов по Лисицыну Д. Н.

Аппаратура для метода определения сахаров:

  • Весы аналитические,
  • Баня водяная с термостатом,
  • Две печи электрические,
  • Отсасывающий насос,
  • Песочные часы на 2 и 3 минуты,
  • Бюретки для титрования, колбы Бунзена и воронки Бюхнера,
  • Колбы мерные 100 мл,
  • Колбы плоскодонные 100 мл, пипетки на 10 и 20 мл.

Реактивы для метода определения сахаров:

  • 20% раствор HCl (496 мл в 1 л H2O d = 1,19);
  • 6% раствор CuSO4 (60 г CuSO4 в 1 л H2O);
  • 1,25% раствор NaOH (12,5 г в 1 л H2O);
  • Раствор Фелинга I (72г CuSO4 в 1л H2O);
  • Раствор Фелинга II (360 г сегнетовой соли (К-Na виннокислый), которую отдельно растворяют в воде + 120 г NaOH. Осторожно перемешивают и доводят водой до 1л)
  • Железо-аммонийные квасцы (86 г квасцов растворяют при нагревании примерно в 500 мл воды. Переносят в колбу на 1 л, добавляют 109 мл H2SO4, после охлаждения доводят водой до 1 л. Перед использованием квасцов оттитровывают в бело-розовой окраски);
  • H2SO4 — концентрированная (d = 1,84);
  • 1/30н KMnO4. Используем фиксаналы 0,1 н KMnO4. Содержание фиксаналу растворяем в 3 л дистиллированной воды, кипятим не менее часа. Раствор оставляем на 7 — 8 суток. После этого устанавливаем коэффициент поправки: титра 0,1 н щавелевой кислоты. Фиксанал щавелевой кислоты растворить в 1 л воды.
  • Для установления титра KMnO4 налить в 3-4 конических колбы на 100 мл по 15 мл щавелевой кислоты, 2 мл концентрированной H2SO4 и титровать 1/30 н KMnO4 в бело-розовой окраски, не меняет цвет в течение 2 минут.
  • Количество щавелевой кислоты (мл), взятой на титрование, умножить на ее нормальность (0,1 н) и разделить на количество мл 1/30 н KMnO4, ушедшего на титрование.

Ход определения сахаров:

Для приготовления вытяжки 2 г сухой растертой вещества и помещали в сухую мерную колбу на 100 мл, заливаем 20 мл дистиллированной водой t = 40 0C, хорошо смешивали и помещали на водяную баню при t = 65-70 0C на 1 час, взбалтывая каждые 15 минут . Затем снимали с купола. После чего колбы охлаждали до комнатной температуры, добавляли фермент и выдерживали в термостате 30 мин. при t = 58 0C. После этого фильтровали в плоскодонные колбы на 100 мл через складчатый фильтр. Полученный профильтрованный раствор и будет начальным (А).

При определении моносахаров по Лисицыну и Бертрану в колбу Ерленмейера на 100 мл помещали 2 мл исходного раствора А, добавляли 10 мл воды, 5 мл раствора Фелинга I и 5 мл раствора Фелинга II (эти растворы можно влить в одну емкость в одинаковых количествах и для анализа принимать по 10 мл). Колбы ставим на горячую плитку, нагреваем течение 3 минут (за это время они закипают). Начало кипения замечали по первым пузырьках. Кипятили ровно 2 минуты. Затем фильтровали в колбу Бунзена через воронку Бюхнера через воронку Шотта. Отсасывали жидкость с помощью насоса Комовського.

Колбы и воронку промывали горячей водой (3 раза). После этого воронку ставили в чистую колбу Бунзена. В воронке находился осадок красного цвета. Такой же осадок был и в колбе. Осадок в колбе растворяли 10 — 15 мл железо-аммонийных квасцов, ополаскивая ними 2-3 раза колбу. Выливали квасцы с растворенным в них осадком из колбы в воронку Бюхнера. Осадок в воронке тоже растворялся. Колбу несколько раз полоскали холодной водой, выливали воду в воронку и отсасывали в колбу Бунзена. Титровали 1/30 н KMnO4. Результаты титрования записывали в журнал и делали расчеты.

Расчет содержания моносаридов. Допускали, что на титрование нашей пробы пошло 31,6 мл 1/30 н KMnO4. Для исследования брали 2 мл отфильтрованного подъемника (раствор А), навеска сухого вещества 2 г.

13,6 мл умножим на коэффициент поправки титра:

13,6 * 0,9789 = 13,31 мл.

По таблице Лисицина сколько мг глюкозы соответствует нашим 13,31 мл. Это значение равно 14,04 мг глюкозы. Делали следующий расчет:

Примечание:

  • Приготовленную вытяжку (раствор А) можно хранить сутки в холодильнике.
  • Прокипяченную с раствором Фелинга пробу для определения сахара нельзя оставлять на время более 1 часа. Необходимо продолжить определение до конца, поскольку осадок закиси меди может частично окислиться, что повлечет за собой заниженные результаты.
  • При промывке красного осадка закиси меди необходимо, чтобы над ним находился слой жидкости, иначе закись меди может окислиться.
  • Для сокращения анализа дисахаров: раствор (А) надо поставить в колбах в баню и тогда температура в контрольной колбе с водой будет 67-70 0С. В испытательную колбу влить 1,5 мл HCl (d = 1,19) — тогда гидролиз проводят в течение 6-8 минут.

Метод определения моносахаридов Макена и Шоорля

В коническую колбу емкостью 250 мл отбирали 1 мл вещества, анализируется, 20 мл дистиллированной воды, по 10 мл растворов Фелинга I и Фелинга II.

Ставили колбу на горячую электрическую печь, нагревали смесь до кипения и кипятили 2 минуты.

Кипения должно быть умеренным. Выпадал в осадок окись меди. Колбу быстро охлаждали под струей воды.

Затем в колбу добавляли 20 мл 10% — го раствора KИ и 15 мл 20% — го раствора серной кислоты. Делали немедленное титрования йода, выделившегося 0,1 н тиосульфатом натрия до перехода коричневой окраски в светло-желтое.

Затем перед концом титрования добавляли 0,5 — 1 мл раствора крахмала и медленно дотитровуют раствор до полного исчезновения синего цвета, раствор оставался окрашенным в кремовый цвет вследствие образования йода меди.

Параллельно ставили контрольную колбу, где вместо раствора углеводов 20 мл воды.

По разнице в титровании контрольного и опытного раствора находили количество тиосульфата и с помощью эмпирической таблице соответствующий ему содержание глюкозы.

Расчет содержания глюкозы.

Рассмотрим на примере: 21,9 мл тиосульфата натрия пошло на титрование исследуемого раствора, 30,7 мл тиосульфата натрия пошло на титрование контрольного раствора.

Разница затрат раствора тиосульфата натрия равна:

30,7 — 21,9 = 8,8 мл

Смотрим по таблице содержание сахара. Необходимого значения не имеет, поэтому складываем пропорцию:

Так в 1г муки — 0,339 г глюкозы.

Проанализировав и попробовав два метода, решили использовать при исследовании методику Макена и Шоорля. Она является более экономически выгодной и менее энергозатратной, т.е. не требует использования дорогостоящего оборудования такого, например, как колба Бунзена, воронка Бюхнера и насос Комовского.

Автор статьи: Сушко А.

 

Метки: ,