После отбора экспланта следует уделить особое внимание его стерилизации. Изолированная ткань, орган, клетка растения могут успешно расти на питательных средах только при условии ограждения их от конкуренции с микроорганизмами. Поверхностные покровы всех органов растений обычно загрязнены спорами различных микроорганизмов и грибов. Однако внутренние ткани здоровых растений считаются стерильными, хотя и в них могут находиться непатогенные бактерии, которые не всегда обнаруживаются. Стерилизация растительных объектов заключается в уничтожении грибных и бактериальных спор на внешней поверхности без повреждения внутренних тканей. Вид стерилизующего вещества, его концентрация и длительность применения зависят от плотности и чувствительности ткани, которая должна быть стерилизована. Правильный выбор стерилизующего средства заключается в том, чтобы оно губительно действовало на все микроорганизмы и в то же время минимально повреждало ткани. Трудность этой проблемы особенно проявляется при стерилизации объектов, имеющих трещины, повреждения, углубления (например, некоторые семена, плоды). В этих случаях требуется не только поверхностная стерилизация, но и проникновение стерилизующего раствора внутрь, что может быть очень рискованным для дальнейшего роста экспланта. Следующим важным условием является то, что стерилизующее вещество должно легко удаляться из ткани промыванием дистиллированной водой или подвергаться разложению. В противном случае происходит отравление ткани, которое будет отрицательно влиять на культивирование эксплантов. Поэтому для получения удовлетворительных результатов обычно пользуются уже известной техникой стерилизации данного объекта или же разрабатывают ее экспериментально для каждого конкретного случая, так как один и тот же орган у разных растений требует различных условий стерилизации (Калинин и др., 1980). Наличие любой инфекции влияет на рост эксплантов или культур. Инфицированность культур растений грибами и бактериями обычно выявляется через 2-7 суток после культивирования на питательных средах. Инфицированные культуры необходимо тотчас же удалять, так как их присутствие приводит к дальнейшему заражению воздуха в культуральной комнате. Наличие инфекции свидетельствует о неэффективности применяемого метода поверхностной стерилизации. Выживание микроспор после поверхностной стерилизации зависит от типа используемого экспланта, стерилизующего агента и времени обработки.
Правило, по которому следует выбирать наиболее пригодный стерилизующий раствор, довольно простое: вещество должно обеспечивать наибольший процент неповрежденных тканей, способных к росту и новообразованиям, при наименьшем % инфицирования. Этого правила следует придерживаться и при выборе продолжительности стерилизации. При правильном выборе стерилизующего вещества размер инфицирования эксплантов не превышает 1-3 %.
Перед стерилизацией эксплант должен пройти первичную очистку. Для работы с тканями корнеплодов моркови желательно брать растения определенного сорта. Отбирают здоровые, не поврежденные вредителями корнеплоды, хранящиеся при температуре 4°С. Их чистят, тщательно моют в мыльном растворе и затем стерилизуют.
В стерилизующие растворы добавляют эмульгаторы типа Tween-20 (Polyoxyethylenesorbitanmonolaurate) в соотношении 1 капля:100 мл раствора, которые способствуют лучшему распределению стерилизатора по поверхности экспланта и, следовательно, исключают выживание микроорганизмов. При отсутствии Tween-20 можно использовать коммерческие препараты жидких моющих средств. После стерилизации экспланты промывают не менее трех раз (по 10 мин) в стерильной дистиллированной воде для удаления стерилизующих веществ. Для стерилизации объектов и для промывки в стерильной воде обычно используют простерилизованные стаканы, закрытые чашками Петри. Если объект не тонет в стерилизующем растворе, рекомендуется сверху поместить вату.
При стерилизации мелких объектов, используемых в большом количестве, т. е. семян и бутонов, они помещаются в марлевые мешочки, затянутые сверху ниткой, которые пинцетом переносят из одного сосуда в другой. По истечении времени стерилизации растительный материал стерильным пинцетом переносят в сосуды со стерильной водой, выдерживая в каждом из них по 10-15 минут. Простерилизованные и промытые объекты, помещенные в стерильные чашки Петри или Коха, готовы для дальнейших манипуляций с ними и посадки их на питательные среды.
Стерилизация и промывка эксплантов более эффективно проходят при механическом перемешивании с помощью мешалки.
Последнее время для стерилизации эксплантов используются шприцы. При этом достигается ряд преимуществ: снижается расход стерилизующих растворов; обеспечивается максимальное смачивание эксплантов; происходит лучшая промывка эксплантов.
Источник: Тюкавин Г. Б. Основы биотехнологии моркови: Монография / ВНИИССОК. – М., 2007. – 480 с.
Автор фото в статье: Ляпустина Е.В.