Виділення чистих культур за методом Коха
Для одержання ізольованих колоній за методом Коха і виділення з них чистих культур аеробних бактерій роблять посів на поверхню твердого живильного середовища у чашки Петрі з накопичувальної культури:
– Розплавляють стерильне агаризоване сусло в колбі на водяній бані і розливають його в 3-4 стерильні чашки Петрі.
– М/о висівають і розподіляють шпателем Дригальского чи петлею, використовуючи техніку виснаженого штриха чи мазка (рис. 1) послідовно в декількох чашках Петрі з застиглим твердим агаризованим середовищем.
– Спочатку на поверхню середовища першої чашки, використовуючи петлю, наносять краплю розведення накопичувальної культури та обережно розтирають її стерильним скляним шпателем по всій поверхні.
– Потім цим же шпателем із клітинами мікроорганізмів, що залишилися на ньому, засівають поверхню другої чашки. Далі цим же шпателем проводять вздовж поверхні третьої чашки Петрі.
– Після посіву чашки необхідно перевернути нагору дном і поставити в термостат із температурою, що сприятлива для даного мікроорганізму.
– Інкубують посіви звичайно протягом 2-5 днів (у залежності від швидкості росту конкретних мікроорганізмів).
– Таким чином, після інкубації у перших чашках звичайно спостерігається суцільний ріст мікроорганізмів (суцільний «газон»), а в наступних утворюються ізольовані колонії. У випадку засіву за секторами у перших відбувається суцільний ріст, а уздовж наступних штрихів виростуть відособлені колонії м/о, що представляють потомство однієї клітини.
– Ізольовані колонії відсівають петлею в пробірки на поверхню скошеного густого середовища чи в рідке середовище.
– Усі операції з посівів мікроорганізмів виконуються стерильно біля вогню.
Рис.1. Розсів мікроорганізмів на поверхню твердого середовища:
а – шпатель Дригальского; б – розсів; в – ріст мікроорганізмів післярозсіву шпателем; г – ріст мікроорганізмів після розсіву петлею.
Метод количественного подсчета микроорганизмов на плотных питательных средах
Метод Коха – найбільш розповсюджений спосіб кількісного обліку м/о. Сутність методу полягає в посіві певного об’єму досліджуваної суспензії м/о на тверде середовище в чашки Петрі і наступному підрахунку числа колоній, що виросли. При цьому приймають, що кожна колонія утворюється розмноженням однієї клітини.
Цей метод дозволяє вести облік тільки життєздатних м/о. В аналізі беруть стерильно 1 мл суспензії і поміщають у 9 мл стерильної водопровідної води чи фізіологічного розчину, потім роблять ряд послідовних розведень (рис.2).
Ступінь розведення перед посівом визначається передбачуваною кількістю м/о в зразку.
Рис.2. Схема готування розведення і посіву суспензії мікроорганізмів
Підрахунок колоній, що виросли, проводять через певний час після посіву (3-5 доби). Спорові й без спорові форми бактерій на МПА зазвичай враховують на 2-3 добу інкубації.Колонії, як правило, рахують, не відкриваючи чашки Петрі, у світлі, що проходить. Для зручності дно чашки поділяють на сектори, підраховують кількість колоній у кожнім секторі, кожну відлічену колонію позначають крапкою (маркером) із нижньої сторони чашки Петрі й результати підсумовують. Для підрахунку колоній зручно користуватися спеціальним приладом з лічильником.
Точність методу залежить від числа підрахованих колоній: кращим розведенням вважають те, у висіві якого на твердому живильному середовищі виростає від 50 до 150 колоній.
Підрахувавши кількість колоній на всіх паралельних чашках, обчислюють їх середнє число на одній чашці і потім роблять перерахування для визначення вмісту м/о в 1 г ґрунту за формулою
N=а*b*c
де N – кількість клітин у 1 г субстрату;a – середня кількість колоній на чашці; b – розведення, із якого зроблений посів;c – кількість крапель у 1 мл суспензії.
Підрахунок чисельності кліток мікроорганізмів у рахункових камерах
Метод кількісного обліку м/о за допомогою рахункових камер має обмежене застосування, пов’язане з тим, що в цьому випадку виконується облік усіх кліток м/о без їхньої диференціації на живі й мертві клітини. Крім того, рахункові камери можуть бути використані лише для підрахунку щодо відносно великих об’єктів – кліток водоростей, дріжджів, спор, грибів, що можна дослідити методом мікроскопії з об’єктивами 8х-40х.
У випадку рухливості клітин препарат незначно підігрівають (чи додають краплю 0,1% розчину агар-агару). Фіксація і фарбування препаратів призводить до деяких змін розмірів мікробних кліток.
Рахункова камера Горяєва являє собою товсте предметне скло з нанесеними на ньому поперечними прорізами, що утворять три поперечно розташовані плоскі площадки (рис. 3). Середня площадка подовжнім прорізом розділена навпіл, причому на кожній половині нанесена квадратна сітка. Дві бічні площадки розташовано на 0,1 мм вище за середню. Ці площадки служать для притирання покривного скла. Сітка розділена на визначене число згрупованих великих і маленьких квадратів.
Постійною величиною у всіх сітках є маленький квадрат, сторона якого дорівнює 1/20 мм, площа його 1/400 мм2, а об’єм при висоті камери 1/10 мм – 1/4000 мм3 чи 1/4000000 мл. Так називаний великий квадрат складається з 16 малих квадратиків.
Камера Горяєва має площу 9 мм2, об’єм камери – 9 мм3 і розбита на 225 великих квадратів (15 рядів по 15 великих квадратів у кожнім ряду).
Підрахунок кліток у камері починають через 3-5 хвилин після заповнення її, коли клітини осіли й розташувалися в одній площині. Підрахунок кліток ведуть звичайно в 10 великих або в 20 малих квадратах, переміщаючи її за діагоналлю. З вихідної суспензії варто приготувати 3-4 кратні розведення.
Рис. 3 – Рахункова камера Горяєва:
А -вид зверху; Б – вид збоку; В – вид камери Горяєва з малим збільшенням мікроскопа.
Готують спочатку препарат із досліджуваної культури мікроорганізмів і підрахувують кількість клітин у вихідній суспензії.
Мікробіологічною петлею краплю, суспензії мікроорганізмів наносять у центр рахункової камери. Рахункову камеру покривають покривним склом, ретельно притираючи його з країв до утворення ньютонівських кілець (кольорових смуг).
Підрахунок клітин мікроорганізмів робити (із збільшенням мікроскопа: окуляр 10-15х, об’єктив 20-40х) у 20 малих квадратах, у 3-4 пробах досліджуваної суспензії. Загальне число підрахованих кліток мікроорганізмів повинне бути не менш 600, тому беруть 3-4 проби з досліджуваної суспензії для монтажу камери.
Потім розраховують середнє число мікробних кліток в одному малому квадраті і роблять перерахування на вміст у 1 мл вихідної суспензії за формулою:
N=a*1000*n/h*s
де N- число клітин у 1 мл суспензії; а — середнє число клітин у малому квадраті сітки; h-глибина камери в мм, s-площа малого квадрата сітки в мм2, n-розведення вихідної суспензії, 1000 – коефіцієнт перерахування мм3 у мл.