Рост микробной культуры состоит из роста отдельных клеток и увеличения их числа. Поэтому для измерения роста культуры лучше определять общую массу живых клеток. Однако, сделать это практически бывает нелегко: в зрелых культурах часть клеток отмирает, и нет еще способа, чтобы отделить их от живых клеток. Поэтому обычно ограничиваются определением общей массы клеток, без разделения их на живые и мертвые. Такой прием особенно применим в отношении молодых культур, где мертвых клеток мало.
Биомассу культуры определяют следующими способами:
- Отделяют клетки от среды фильтрованием или центрифугированием, а затем измеряют их общий объем после распределения на центрифуге. Определяют массу клеток путем взвешивания.
- Определяют количество азота в отцентрифугированных клетках, считая, что азот пропорционален белковой массе клеток.
- Измеряют помутнение среды, вызванное клетками микробов. Мутность определяют либо визуально, сравнивая их со стандартными суспензии, либо определяют оптическую плотность нефелометрически по распределению шкалы гальванометра.
- В других методах о величине биомассы культуры судят по числу клеток. Такая замена оправдывается тем, что в течении развития культуры число клеток увеличивается в сотни раз, тогда как средний объем одной клетки изменяется максимум в 10-20 раз, да и то не всегда.
Число клеток определяют двумя способами:
- Высевом на плотные среды и подсчетом выросших колоний, принимая, что каждая колония развилась из одной клетки (что не совсем верно).
- Прямым определением числа клеток с помощью счетной камеры на фиксированных и окрашенных препаратах. В отличие от метода колоний, прямой счет позволяет учесть все имеющиеся в жидкости клетки, но зато не дает вполне надежного критерия для распределения живых и мертвых клеток (их можно различать по характеру окраски).
Наконец, благодаря своей простоте широкое распространение получили непрямые методы, в которых о росте микробов судят по образованным ими химическим продуктам. Если количество продуктов не вполне пропорционально живой массе микробов, то во всяком случае оно находится в прямой зависимости от этой массы. Поэтому для сравнительных целей такие методы вполне допустимы. Как продукты обмена измеряют объем (вес) выделенного газа (О2, Н2) или кислотность среды (путем титрования щелочью или по изменению рН среды).
Процесс роста микробной культуры характеризуется следующими показателями: во-первых, производительностью роста, таким образом величиной выросшей биомассы культуры, во-вторых, скоростью роста, т.е. прироста биомассы в единицу времени – за час или за день. При этом различают удельную скорость (или интенсивность) роста, судя о ней по средней скорости роста каждой одиночной клетки, и общую скорость роста, имея при этом в виду суммарное нарастания всей массы клеток в культуре. Величина общей скорости роста культуры представляет собой произведение двух величин: удельной скорости роста одной клетки и числа растущих клеток.
Иногда как показатель роста используют величину, обратную удельной скорости роста – среднее время (продолжительность) одной генерации, то есть промежуток времени между двумя последовательными распределением (или почкованием). Рост микробных культур схематично можно разделить на четыре периода. Однако эти периоды характеризуются не только изменением темпа размножения клеток, но и закономерными морфологическими и физиологическими изменениями.
Рисунок – Кривая роста и развития микроорганизмов в периодической культуре
Первый период – эмбриональный или «лаг-фаза». В это время «отдыхающие» клетки пробуждаются к жизни, а вегетативные – омолаживаются и приспосабливаются к новой среде. Рост происходит сначала очень замедленно, затем – все более и более ускоряется. В этот период омоложения и приспособления клетки испытывают очень значительные морфологические и физиологические изменения. Их размеры обычно увеличиваются, а протоплазма клеток становится сильно базофильной (т.е. начинает хорошо краситься щелочными красителями). Такие «эмбриональные» клетки бывают особенно чувствительны к внешним воздействиям.
Второй период развития – период логарифмического роста. К началу этого периода клетки полностью заканчивают омоложение и достигают расцвета своей физиологического активности. Поэтому удельная скорость роста клеток достигает максимума, а средняя продолжительность генерации сокращается до минимума. Однако общая скорость роста культуры в начале логарифмического периода все еще невелика, так как число клеток, размножающихся, пока незначительное. Общая скорость роста культуры увеличивается постепенно в зависимости от увеличения числа клеток и достигает своего максимума немного позже, когда размножение каждой отдельной клетки починает уже слегка замедляться. В период логарифмического роста культуры клетки приобретают свои типовые размеры и становятся постепенно более оксифильнымы, т.е. начинают лучше краситься кислыми красками и хуже – основными. Их устойчивость к неблагоприятным внешним факторам повышается.
Логарифмическая период роста продолжается в течение нескольких часов, а затем в связи с замедлением размножения клеток кривая роста начинает все больше и больше наклоняться к оси абсцисс, пока не примет, наконец, горизонтального направления. Этот период видимого прекращения роста культуры называют периодом зрелости, максимальной стационарной фазой роста. В этот период культура достигает максимального числа клеток, максимального развития их «энзиматической конституции», максимального усложнения их строения (в виде разного рода внутреннеклеточных структур и включений). В этот период культура выглядит особенно неоднородно. Наряду со зрелыми или отмершими клетками в ней появляются неподвижные формы (например, споры). Обмен веществ всех таких клеток происходит менее интенсивно и поэтому жизненная активность культуры в целом начинает затухать.
После этого наступает последний этап развития – период старости, период регрессивного развития, когда отмирание клеток (начавшееся еще в начале предыдущего периода) перевешивает их образование. В этой связи общая численность культуры постепенно уменьшается. Остаются главным образом стойкие неподвижные формы, так называемые перерожденные «инволюционные» клетки. Жизнедеятельность культуры замирает и падает до нуля. Жизненный путь их заканчивается.