Развитие зародыша кукурузы in vivo

Динамика развития зародыша кукурузы in vivo

Исследовано динамику развития и строение зародыша у кукурузы в природных условиях на примере гибрида ДК633/266´ДК411. Установленная последовательность в формировании основных элементов зародыша модельного гибрида в зависимости от его возраста может быть использована в биотехнологических исследованиях для изоляции зародыша на соответствующей стадии развития. На 14-е сутки после опыления сформированы все основные структурные элементы зародыша кукурузы.

Введение

Процесс двойного оплодотворения лежит в основе семенной репродукции и обеспечивает колоссальные эволюционные преимущества цветковым растениям. Это явление считается ключевым моментом в развитии растительного организма. В процессе двойного оплодотворения женские гаметы (гаплоидная яйцеклетка и диплоидная центральная клетка зародышевого мешка) объединяются с мужскими гаметами (двумя гаплоидными спермиями пыльцевого зерна), в результате чего возникают диплоидная зигота и триплоидная первичная клетка эндосперма. Зигота дает начало зародышу – новому растительному организму, а из первичной клетки развивается эндосперм, который играет важную роль в формировании и созревании зародыша, прорастании семени и начальных этапах жизнедеятельности проростка. Тип эмбриогенеза и тип эндоспермиогенеза закреплены генетически и являются постоянными в пределах вида, а скорость развития зародыша и эндосперма, их размеры, соотношения структурных элементов и физиологические особенности характеризуются внутривидовым разнообразием, зависят от генотипа и условий произрастания материнского растения.

Исследования по сравнительному эмбриогенезу внесли важный вклад в развитие теоретической биологии, в частности, в понимание феноменов дифференциации и дедифференциации клеток, закономерностей амфимиксиса и апомиксиса и их значения в семенной репродукции цветковых растений. Сравнение развития половых и апомиктических зародышей цветковых, зиготических и соматических, включая андрогенные, показало общность путем эмбриогенеза для спорофитных и гаметофитных структур различного уровня плоидности [7; 13], что говорит о главенствующей роли тотипотентности в судьбе клеток растительного организма. В исследованиях, выполненных в последние годы, продемонстрировано, что гены, функционирующие в раннем эмбриогенезе и эндоспермиогенезе, экспрессируются в том числе и в структурах, возникших не в результате оплодотворения, и тем не менее приводят к формированию зародышеподобных структур [10; 13]. Развернувшиеся исследования молекулярно-генетического контроля автономного развития зародыша и эндосперма, известного для некоторых видов в норме, а для других лишь у мутантных форм [12], позволяют прогнозировать широкие возможности использования отклонений от типичного полового воспроизведения у цветковых растений как для решения фундаментальных, так и практических задач.

Изучение эмбриогенеза имеет прикладное значение для таких областей как селекция и биотехнология растений. Большинство биотехнологических разработок основано на использовании в качестве эксплантатов генеративных органов и эмбриональных структур, таких как пыльник, пыльцевое зерно, семязачаток, яйцеклетка, молодые семена, эндосперм и, в особенности, зародыш. Зародыши различного возраста составляют основу эмбриокультуры in vitro для решения проблем прорастания, межвидовой и внутривидовой гибридизации, покоя семян, хранения незрелого селекционного материала и получения дополнительных генераций в течение года, искусственного оплодотворения, культуры зигот и проэмбрио [4; 15]. У злаков незрелые зародыши являются наилучшими эксплантатами для получения каллусной ткани и регенерации растения в биотехнологических исследованиях, включая генно-инженерных манипуляции.

Изучению эмбриогенеза у кукурузы посвящен ряд публикаций [1; 2; 8; 9; 17 и другие], в которых несмотря на некоторые спорные моменты в целом дана морфогенетическая и ультраструктурная характеристика последовательных стадий гисто- и органогенеза зародыша. В работах последних лет большое внимание сосредоточено на молекулярно-генетических аспектах эмбриогенеза, сложных взаимоотношениях материнского и отцовского геномов в зиготе, зародыше и эндосперме, что проявляется в феномене импринтинга, на морфогенетических корреляциях развития зародыша и эндосперма, характеристике сигналов, задействованных в регуляции экспрессии определенных генов в этих структурах. Особое значение изучение дифференциальной экспрессии генов в зародыше, эндосперме, ее регуляция и координация приобретают для гибридных форм кукурузы в связи с проявлением гетерозиса с самых ранних этапов формирования спорофита [6; 11; 14; 16 и другие].

Развитие селекции кукурузы ставит новые задачи перед биотехнологией этой культуры. Одна из таких перспективных задач – это разработка технологии искусственного оплодотворения и доращивания invitroполученных зигот, зародышей и семян [5]. Для развития работ в этом направлении очень важным является знание особенностей развития зародыша, включая тайминг наступления тех или иных стадий, в конкретных условиях произрастания у определенного генотипа для сравнения с развитием зародыша in vitro. В связи с этим целью данного исследования было изучение динамики эмбрионального периода развития зародыша в естественных условиях у модельного гибрида кукурузы.

Материал и методы исследований

Материалом исследования служили зерновки различного возраста модельного позднеспелого гибрида кукурузы ДК633/266´ДК411. Растения кукурузы выращивались в полевых условиях Днепропетровской области с мая по август по общепринятой методике выращивания. Зерновки с зародышами фиксировали темпорально с первых по четырнадцатые сутки после опыления фиксатором FAA. Постоянные микроскопические препараты готовили по общепринятой методике [3]. Толщина срезов составила 12 микрон. Применяли метод тройного окрашивания постоянных препаратов сафранином по Картису, альциановым синим и гематоксилином по Эрлиху. Анализ постоянных препаратов проведен под микроскопом МИКМЕД-5, микрофотографии получены с помощью фотоаппарата CanonPowerShotA590 IS.

Завязь в цветке на початке исследованного гибрида кукурузы одногнёздная, содержит один семязачаток. Семязачаток сидячий, с мощно развитой плацентохалазой, крассинуцелятный, битегмальный (Рис. 1, а). Микропиле сформировано сомкнутыми концами внутреннего интегумента. Нуцеллярный колпачок присутствует до 3-х суток после опыления.

На 1-е сутки после опыления в зародышевом мешке сохраняются остатки синергид с хорошо различимым нитчатым аппаратом и более 15 антипод. Зигота имеет полярное строение, ядро и густая цитоплазма сконцентрированы в апикальной части, крупная вакуоль — в базальной (Рис. 1, б). Эндосперм ядерный.

На 3-и сутки после опыления (Рис. 1, в) тело зародыша имеет шаровидную форму и на поперечных срезах характеризуется радиальной симметрией. Зародыш имеет подвесок, эндосперм заканчивает переход к клеточной стадии.

На 6-е сутки после опыления (Рис. 1, г) эпидерма, которая дифференцировалась в базипетальном направлении, полностью сформирована. Зародыш имеет булавовидную форму. Тело зародыша сферическое, клетки мелкие, густоплазменные, подвесок достигает значительной длины, его клетки вытянуты в продольном направлении и сильно вакуолизированы.

На 7-е сутки (Рис. 1, д, е) вследствие активных клеточных делений происходит разрастание апикально-латеральной области тела зародыша со стороны плацентохалазы, что ведет к вычленению семядоли, или щитка. На 7-8-е сутки наблюдается значительный линейный рост за счёт увеличения подвеска и деления клеток в области тела зародыша.

На 8-е сутки происходит обособление зародышевой оси со стороны, противоположной выделившемуся щитку (Рис. 2, ё). Первой на зародышевой оси вычленяется точка роста стебля. В дальнейшем в процессе органогенеза в зародыше происходят сложные преобразования, в результате которых щиток смещается из латерального положения в терминальное, а точка роста побега – из терминального в латеральное.

На 9-е сутки после опыления хорошо просматривается зародышевая ось. На продольных срезах зародыш имеет характерную форму (Рис.2, ж). Подвесок становится массивным, происходит дальнейшее увеличение тела зародыша и дифференциация точки роста стебля.

У 10-11-суточных зародышей происходят активные деления в апексе побега и обособление колеоптиля (Рис. 2, з, и). Наблюдается повышение меристематической активности в радикулярной области зародышевой оси и формирование прокамбиальных тяжей в щитке.

На 13-е сутки происходит вычленение инициалей главного зародышевого корня, идет дифференцировка прокамбиального тяжа в щитке (Рис. 2, к), четко выражена почечка зародыша.

14-суточные зародыши массивные (к), клетки эндосперма к этому времени заполнены крупными глобулами крахмала (л). На этой стадии сохраняется подвесок (м, н), в почечке присутствуют меристема стебля, две пары настоящих листьев и колеоптиль (о). В корневой зоне выделяется мощная колеориза и эндогенно вычленившийся зародышевый корень (п). В последнем хорошо различимы чехлик, меристематическая зона, начинается дифференциация проводящей системы.

 

Заключение

Таким образом, у гибрида кукурузы ДК633/266´ДК411 на 14 сутки после опыления оказываются сформированными все органы зародыша. Выявленная последовательность в формировании основных элементов зародыша модельного гибрида в зависимости от количества суток, прошедших с момента опыления, может быть использована в биотехнологических исследованиях для изоляции зародыша на заданной стадии развития.        

Библиографичекие ссылки

1. Батыгина Т. Б. Хлебное зерно: Атлас. – Л.: Наука. Ленинград. отд., 1987. – 103 с.
2. Батыгина Т. Б. Graminad-тип эмбриогенеза. – В кн. Эмбриология цветковых растений. Терминология и концепции. Т.2. – СПб.: Мир и семья-95, 1997. – С. 520 – 526.
3. Паушева З. П.Практикум по цитологии растений. – М.: Колос, 1970. – 255 с.
4. Сатарова Т. М. Андрогенез та ембріокультура у кукурудзи in vitro: Автореф. дис… доктора біол. наук. – Дн-ськ, 2003.–42с.
5. Сатарова Т. Н. Искусственное оплодотворение и перспективы его использования у кукурузы // Вісник Дніпропетровського університету. Сер. Біологія. Екологія. – 2006. – Вип.14. – Т.1. – С. 172–176.
6. Соколов В. А. Импринтинг у растений // Генетика. – 2006. – Т.42, № 9. – С. 1250–1260.
7. Сравнение путей морфогенеза в культуре андрогенных и зиготических зародышей кукурузы / Т. Н. Сатарова, Е. В. Ляпустина, Н. В. Заколесник, С. М. Лисицкая // Биология клеток растений in vitro и биотехнология. Тезисы IX Междунар. конф. – М.: ИД ФБК-ПРЕСС, 2008. – С. 332.
8. Чеботарь А. А. Эмбриология кукурузы. – Кишинев: Штиинца, 1972. – 383 с.
9. Abbe E.Growth of the shoot apex in maize embryogeny / E. Abbe, O. Stein // Amer.J.Bot. – 1954. – V. 41, N 4. – P. 285 – 293.
10. Analysis of ZmAE3 upstream sequences in maize endosperm and androgenic embryos / S. Sevilla-Lecoq, F. Deguerry, E. Matthys-Rochon et al. // Sex. Plant Reprod. – 2003. – Vol.16. – P.1–8.
11. Cell cycle regulatory genes from maize are differentially controlled during fertilization and first embryonic cell division / M. Sauter, P. von Wiegen, H. Lörz, E. Kranz // Sex. Plant Reprod. – 1998. – Vol.11. – P.41–48.
12. Curtis M.D.Molecular control of autonomous embryo and endosperm development // M. D. Curtis, U. Grossniklaus // Sex. Plant Reprod. – 2008. – Vol.21. – P.79–88.
13. Functional genomics of microspore embryogenesis / J. Hosp, S. Maraschin, A. Touraev, K. Boutilier // Euphytica. – 2007. – Vol. 158. – P. 275–285.
14. Meyer S.Heterosis associated gene expression in maize embryos 6 days after fertilization exhibits additive, dominant and overdominant pattern / S. Meyer, H. Pospisil, S. Scholten // Plant Molecular Biology. – 2007. – Vol. 63, N 3. – P. 381–391.
15. Raghavan V.Some reflections on double fertilization, from its discovery to the present // New phytologist. – 2003. – Vol. 159. – P. 565–583.
16. Timingof the maternal-to-zygotic transition during early seed development in maize // D. Grimanelli, E. Perotti, J. Ramirez, O. Leblanc // Plant Cell. – 2005. – Vol. 17. – P. 1061–1072.
17. Van Lammeren A. A. M.Development morphology and cytology of the young maize embryo (Zea mays L.) // Acta Bot. Neerl. – 1986. – V. 35. – P. 169 – 188.

Работа поддержана Государственным фондом фундаментальных исследований ДФФД, грант Ф25/206-2008.

Источник: Ляпустина Е. В. Динамика развития зародыша кукурузы in vivo /Е. В. Ляпустина, Т. Н. Сатарова // Вісник Дніпропетровського університету. Біологія. Екологія. – 2009. – Вип. 17, Т. 2. – С. 77-83.

Автор фото в статье: Ляпустина Е.В.