В процессе пересадки (субкультивирования) каллус переносят из колбы или пробирки в стерильную чашку Петри. После асептического отделения старых некротизированных участков и кусочков приставшей агаризованной среды, каллус разделяют на равные части, которые переносят в колбы или пробирки со средой. Интенсивность роста отдельных каллусов одного и того же варианта может значительно варьировать. Эта вариабельность зависит от того, что трансплантаты берут с различных участков исходного каллуса и с разных каллусов. Поэтому отдельные варианты опытов с каллусными культурами должны иметь не менее шести повторностей (Калинин и др., 1980).
Каллусные культуры очень различаются по интенсивности роста, по консистенции, окраске, способности зеленеть на свету и другим свойствам. Клеточные колонии на агаризованной среде могут быть компактными и твердыми, а также рыхлыми, которые при извлечении каллуса распадаются на кусочки. Последний тип каллусов в жидкой среде очень легко отделяет одиночные клетки и дает начало суспензионной культуре. Отмечено, что компактные каллусы могут давать начало рыхлым тканям, но не наоборот (Reinert, White, 1956; Torrey, Shigemura, 1957). Морфологические особенности и консистенция каллуса легко изменяются под действием различных веществ, вводимых в питательную среду и вызывающих изменение метаболизма и, соответственно, морфогенеза тканей. Так, выращивание нормальной ткани партеноциссуса, табака и моркови на среде, содержащей 2,4-Д и кокосовое молоко, приводило к росту по типу рыхлой, бесформенной колонии, тогда как вь1ращивание на среде с ИУК определяло компактный рост ткани (Бутенко, 1964). Анатомическая структура рыхлых каллусов характеризуется множеством организованных центров меристематической активности, разделенных большими недифференцированными клетками. Плотные каллусы менее дифференцированы и содержат много крупных вакуолизированных клеток (Blakely, Steward, 1961; Grant, Fuller, 1968). Существует разница между этими типами каллусов в упаковке клеток: плотные каллусы состоят из тесно упакованных клеток. Обнаружены различия в химическом составе: у плотных каллусов общее количество полисахаридов клеточной стенки выше, но снижен процент содержания целлюлозы по сравнению с пектиновыми веществами и гемицеллюлозами.
По современным представлениям, каллусная ткань, выращиваемая поверхностным способом, представляет собой аморфную массу тонкостенных паренхимных клеток, не имеющую строго определенной анатомической структуры. Цвет массы каллусной ткани может быть белым, желтоватым, зеленым, красноватым, бурым, пигментированным полностью или зонально присутствием хлорофилла и антоцианов.
В зависимости от происхождения и условий выращивания каллусные ткани бывают
- рыхлыми, сильно обводненными, легко распадающимися на отдельные клетки;
- средней плотности, с хорошо выраженными меристематическими очагами;
- плотными, с зонами редуцированного камбия и сосудов (в основном, трахеиподобных элементов).
Как правило, в длительной пересадочной культуре на средах, включающих ауксины, особенно синтетический аналог ауксина — 2,4-Д, каллусные ткани теряют пигментацию и становятся более рыхлыми.
В цикле выращивания каллусные клетки после ряда делений проходят обычный для клетки растения онтогенез, они приступают к росту растяжением, затем дедифференцируются как зрелые каллусные клетки и, наконец, деградируют.
Каллусные ткани, выращиваемые поверхностным способом, часто применяют для сохранения в растущем состоянии коллекций разных штаммов, линий, мутантов, из них получают суспензии клеток, растущих в жидкой питательной среде. Как правило, для регенерации растений предпочитают также каллусные ткани.
Важную роль при выращивании тканевых культур имеют температурные условия, а также интенсивность, продолжительность и качество освещения. Анализ многочисленных экспериментальных данных показал, что для большинства тканей температурный оптимум 24-27°С, с отклонением от него на 2-3°С для отдельных тканей (Бутенко, 1964). При культивировании нормальной каллусной ткани моркови в условиях фитотрона на искусственном свету было показано, что оптимальная температура для их выращивания 20°C (Capite, 1955).
При изучении роста и развития каллусных тканей применяются качественные и количественные критерии. Качественные оценки применяются при изучении процесса каллусообразования из кусочков изолированных тканей, процесса гистогенеза в связи с каллусообразованием и в пассированной культуре, процессов органогенеза в недифференцированной культуре ткани и корреляций между органами при их образовании. Количественные критерии применяются при изучении действия на рост культуры различных внешних факторов. С этой целью используют обычно определение сырого и сухого веса культур, определение поверхности выросшей массы, подсчет числа клеток и определение прироста белкового азота.
Источник: Тюкавин Г. Б. Основы биотехнологии моркови: Монография / ВНИИССОК. – М., 2007. – 480 с.