В основе всех процессов выделения водорода микроорганизмами на свету лежит процесс фотосинтеза. Среди фотосинтезирующих микроорганизмов, способных выделять водород, наибольшее внимание привлекают микроводоросли, гетероцистни цианобактерии и пурпурные несирчани бактерии. Микроводоросли и цианобактерии обладают двумя фотосистемы и выделяют кислород. Бактерии, обладающие одной фотосистемой (прежде всего пурпурные и зеленые, серные и несерные бактерии), не способны к выделению кислорода и для осуществления фотосинтеза им необходим более восстановленные, чем вода, доноры электронов.
Цианобактерии и микроводоросли — это прокариоты, которые в анаэробных условиях могут выделять водород под действием солнечного света как источника энергии и используя воду как источник электронов. Представители этих микроорганизмов содержат гидрогеназы и нитрогеназы, катализирующих образование водорода. Молекулярный кислород влияет на экспрессию гена, который отвечает за гидрогеназы и вызывает инактивацию самого фермента. Исследования ученых направлены на получение мутантов микроводорослей с нечувствительной к кислороду гидрогеназы. На сегодня получено мутант, который на 330% менее чувствителен к кислороду. Разделение во времени выделения кислорода и водорода возможно при недостатке серы в питательной среде, при этом снижается активность фотосистемы, но скорость выделения водорода на 1 л культуры всего достигает 0,15 л, что на 3 порядка ниже необходимы.
На сегодняшний день получение водорода с помощью водорослей считается перспективным, но для практического применения необходимо применение новых подходов для решения существующих проблем.
Наиболее перспективным считается светозависимое выделение водорода гетероцистными цианобактериями за счет действия нитрогеназы, которая локализована в специализированных клетках гетероцисты. Гетероцисты синтезируются в условиях недостатка связанных форм азота и их дополнительной особенностью является отсутствие фотосистемы, т.е. они не способны к выделению кислорода. Таким образом, нитрогеназа пространственно отделена от кислорода, что непременно присутствует в среде в ходе фотосинтеза, при этом кислород образуется в вегетативных клетках, а водород — в гетероцисты. Поскольку эти процессы проходят в разных клетках, они связаны большим количеством промежуточных этапов, включающих диффузию сахаров из вегетативной клетки в гетероцисты. При обычных условиях в процессе азотфиксации цианобактерии не выделяют водород в результате поглощения его пируватгидрогеназой. Мутанты, лишенные этого фермента, выделяют водород, скорость выделения водорода возрастает при отсутствии в атмосфере азота. Эффективность преобразования энергии света в этом случае достигает 1,4%. Проблема заключается в поиске новых более производительных штаммов, их модификации и создании новых биореакторов с равномерным освещением и пространственным разделением выделением водорода и кислорода на газоселективних мембранах.
Пурпурные несерные бактерии способны выделять водород за счет действия гидрогеназы и нитрогеназы. Донорами электронов для фотосинтеза могут служить рядом с восстановленными соединениями серы, летучие жирные кислоты и их производные. Для получения высокой скорости извлечения водорода необходимо создавать анаэробные условия при недостатке азота, интенсивное освещение, оптимальную температуры и рН. На сегодня достигнута скорость выделение водорода 0,25 л / час г сухой биомассы.
Увеличение выхода водорода можно достичь, объединив темновой режим выделения водорода микроорганизмами со светозависимым в пурпурных бактериях, потому что побочным продуктом темнового получения водорода является, в основном, летучие жирные кислоты, которые легко усваиваются пурпурными бактериями. В этом случае можно повысить выход водорода до 4 молей на моль глюкозы в темновом биореакторе и до 8 моль в фотобиореакторах с использованием целлюлозосодержащих отходов.
Все процессы получения биоводорода в будущем могут иметь практическое применение, но на сегодня наиболее перспективными разработками и наименее энергозатратными являются технологии получения водорода с помощью микроорганизмов благодаря использованию отходов различного происхождения в качестве питательной среды. При этом решаются как энергетические, так и экологические проблемы.
Предложено много вариантов модельных систем, катализирующих образование водорода из воды за счет энергии света. Эти системы различаются механизмом улавливания энергии света и содержат хлоропласты или изолированный из них хлорофилл, а также восстановленные никотинамидные нуклеотиды. Некоторые системы вместе с водородом образуют кислород: в этом случае речь идет о биофотолиз воды.
С водородом образуют кислород система хлоропласт — ферредоксин — гидрогеназы. Ферредоксин служит промежуточным переносчиком электронов от фотосинтетической цепи хлоропластов к добавленной гидрогеназы. Серьезной проблемой является поддержание низкого парциального давления этих газов, с тем чтобы не наступило ингибирование гидрогеназы. При замене ферредоксина на флавопротеиды или метилвиологен система образует только Н2. Флавопротеиды и, по некоторым данным, метилвиологен защищают гидрогеназы от ингибирования кислородом; разрабатываются системы с изолированным хлорофиллом, встроенным в детергентные мицеллы или липосомы вместе с гидрогеназами. Предложена также система с гидрогеназами, иммобилизованными в агарозном геле, с которым тесно связан полимерный виологен и металлопорфирин, аналог хлорофилла Водород получают также с применением целых клеток микроорганизмов, стабильность которых возрастает при их иммобилизации. Высокоэффективными продуцентами Н2 являются пурпурные фототрофные бактерии, например Rhodopseudomonas sp. (см. рис.3), которые при иммобилизации в агарозном геле дают до 180 мкмоль Н2 за 1 ч в пересчете на 1 мг бактериохлорофилла. Важное направление работ — поиск продуцентов Н2 с устойчивостью к О2 гидрогеназы.
Рисунок 3 – Rhodopseudomonas ps. электронная фотография в культуре и отдельной клетки
Другим ферментом, который катализирует выделение водорода, является нитрогеназа. Во всех микроорганизмах нитрогеназа состоит из двух компонентов, а именно с MoFeS-протеида (молибдоферредоксина) и FeS-протеида (азоферредоксина). Основной функцией нитрогеназы является восстановление молекулярного азота:
N2 + 8H+ + 8е— + n АТФ ->2NH3 + Н2 + n АДФ + n фосфорная кислота
В отсутствие основного субстрата (N2) нитрогеназа катализирует энергозависимые восстановление Н+ с образованием Н2. Переключение фермента с одного режима работы на другой является технологической проблемой. Один из путей решения — получение штаммов микроорганизмов с нитрогеназой, не утилизирущих азот.
В Японии получен штамм Anabaena sp., который осуществляет биофотолиз воды в режиме, не чувствительном к Н2, О2 и N2. Повышению эффективности биофотолиза воды способствует чередование периодов функционирования биообъекта как продуцента Н2 и О2 с периодами «отдыха», когда клетки фотоассимилируют СО2 (вводимый в этот период в среду культивирования).
Возможно комбинирование процессов получения водорода и других ценных продуктов. В частности, представители рода Clostridium дают органические растворители и в то же время обладают активной гидрогеназой. Если в реакторе с культурой Clostridium saccharoperbutylacetoniocum не создавать оттока для Н2, который выделяется, то наблюдается ингибирование образования водорода и эффективный синтез бутанола, ацетона и этанола. Если обеспечивают свободный отток водорода, то вместе с довольно активным образованием водорода культура синтезирует лишь этанол. Этот пример иллюстрирует возможность управления ходом биотехнологического процесса условиями культивирования биообъекта.
Читайте также: Получение водорода как топлива будущего
Материал статьи любезно предоставил Дохторук Андрей, ст. каф. Микробиология и вирусология, Днепропетровского национального университета им. Олеся Гончара