Метод культуры изолированных пыльников базируется на использованные явления андрогенеза in vitro — получение гаплоидных растений на искусственных питательных средах из изолированных пыльников и микроспор. Использование культуры in vitro пыльников и пыльцы кукурузы — один из альтернативных путей получения гаплоидных клеток, тканей и растений [1, 9, 14].
Экспериментальный андрогенез в культуре пыльников — это комплекс процессов, связанных с переходом пыльцевого зерна с гаметофитного на спорофитний путь развития. Он состоит в получении новообразований из гаплоидных пыльцевых зерен, а из них — растений-регенератнов, которые после обработки полиплоидизирующими веществами превращаются в гомозиготные диплоидные растения, которые могут использоваться в селекции как инбредные линии. При этом сокращаются сроки создания гомозиготного материала с 5-7 лет до 1 года [10].
Известно, что использование гаплоидной техники дает ряд преимуществ, в частности позволяет сократить время на селекционный процесс, в частности на создание гомозиготного исходного материала (с помощью колхицина можно получить полностью гомозиготные диплоидные растения), в гаплоидов легче выявить и отобрать ценные мутации [1, 5, 6, 9, 11, 12]. Интенсивные исследования в области культуры пыльников проводятся в лаборатории биотехнологии Института зернового хозяйства (Днепропетровск). В целом культивирование пыльников, содержащих гаплоидные пыльцевые зерна, с определенной стадии развития приводит к появлению через четыре — шесть недель эмбриоидов или каллусов. Процессы регенерации из этих структур заканчиваются образованием гаплоидных проростков, которые после диплоидизации дают диплоидные растения. Гаплоидные растения, полученные из культуры пыльников или пыльцы, стерильны и не дают семян. Из этих растений можно получить гомозиготные диплоиды. Удвоение числа хромосом достигают обработкой раствором колхицина растений еще на пыльниках или листах, срезанных со взрослых растений.
Наиболее важными условиями для успешного культивирования пыльников для получения диплоидов является подбор реагирующего генотипа, условий выращивания донорных растений, стадия развития пыльцевого зерна, предобработки материала, состав питательной среды и способ диплоидизации [11]. Индукция андрогенеза особенно зависит от состояния пыльцы в момент введения ее в культуру. Для получения гаплоидной ткани пыльники рекомендуется эксплантировать в момент первого митоза или сразу после его прохождения. Методика культивирования пыльников описана во многих книгах [1, 5, 10]. Важно, чтобы пыльники были отобраны из молодых растений, выросших в нормальных условиях освещения. В старых растениях к концу цветения образуются мелкие бутоны, содержащие пыльники с гетерогенной смесью микроспор и большую пыльцу с дефектами.
Отбор через культуру пыльников реагирующих генотипов, аккумуляция благоприятных генов у регенерантов и создание на их основе гибридов с участием хозяйственно-ценных линий могут оказаться одним из путей расширения генетической базы андрогенеза in vitro у кукурузы [7]. На успех культивирования пыльников влияет физиологическое состояние донорной растения, метелки и пыльника. Различия погодных условий в период выращивания донорских растений приводят к тому, что реакция генотипов в культуре пыльников изменяется в разные годы иногда на столько, что у чувствительного генотипа новообразования вообще не появляется.
Индукция андрогенеза in vitro при культивировании изолированных пыльников зависит от многих взаимосвязанных факторов. Один из них — введение в состав культуральной среды определенных фитогормонов (ауксины, цитокинины, гиббереллина, абсцизины, этилен) с определенной концентрацией, хотя выбор оптимальной концентрации экзогенных гормонов носит случайный характер [1, 3, 4]. Еще одним важным фактором, влияющим на индукцию андрогенеза является благоприятная фаза развития микроспор и пыльцевых зерен в момент инокуляции пыльников на / в питательные среды. Состав питательной среды имеет важное значение для успешного культивирования пыльников. Для культивирования пыльников кукурузы наиболее заманчивой оказалась питательная среда, предложенная Геновези и Коллинзом [13]. Для культивирования изолированных пыльников чаще используют питательные среды: среда Уайта, среда Мурасинге и Скуга, среда Нича и Ночь, среда № 6. Варианты сред Potato подходят для культивирования пыльников пшеницы [4]. Из других компонентов, кроме минеральной основы, для образования эмбриоидов важно содержание в среде сахарозы и железа. Для культивирования всех видов пыльников сахароза вводится в состав сред в концентрациях 2-4%, но для некоторых пыльников она должна быть повышена 6-12%. Для нормального развития эмбриоидов необходимо наличие в среде железа, лучше в комплексе с хелатами (Fe ЭДТА). В отсутствие железа проэмбрион развивается только до глобулярной стадии [1]. Изменение консистенции питательной среды от твердой к жидкой способствовало повышению андрогенеза кукурузы в ряде генотипов (100-200 новообразований на 100 пыльников). Не отзывчивые генотипы при культивировании на жидкой среде становились отзывчивыми. Но регенерация в этом случае оказалась затруднена из-за меньших размеров и оводненности новообразований [8]. Основные структуры, которые развиваются в культуре пыльников — эмбриоидов — биполимерные структуры по морфологии сходны с зиготичными зародышами кукурузы, имеют щиток, точку роста стебля и корней.
Перечень литературы
- Калинин Ф.Л., Сарнацкая В.В., Полищук В.Е. Методы культуры тканей в физиологии и биохимии растений. – Киев: Наукова думка, 1980. – 488 с.
- Круглова Н.Н., Горбунова В.Ю. Физиологические основы андрогенеза invitroу злаков // Тез.докл. 3-го съезда ВОФР.Ч.1. Санкт-Петербург. – 1993. – С.86.
- Круглова Н.Н., Горбунова В.Ю. Физиологические аспекты андрогенеза invitroу злаков // Тез.докл. 3-го Российск. симп. “Новые методы биотехнологии растений”. Пущино. – 1995. – С.18.
- Круглова Н.Н., Горбунова В.Ю., Куксо П.А. Морфогенез в культуре изолированных пыльников: роль фитогормонов // – 24 c.
- Мельничук М.Д., Новак Т.В., Кунах В.А. Біотехнологія рослин: Підручник – К.: ПоліграфКонсалтинг, 2003. – 520с.
- Мусієнко М.М. Фізіологія рослин: Підручник. – К.: Либідь, 2005. –808 с.
- Сатарова Т.Н. Некоторые генотипические и онтогенетические особенности реакции кукурузы в культуре пыльников // Цитология и генетика. – 1997. – Т.31, №3. – С.60 – 65.
- Сатарова Т.Н. Культивирование пыльников кукурузы на жидкой питательной среде // Вісник Дніпропетровського університету. Сер. Біологія. Екологія. – 1999. – Вип.6. – С.135 – 143.
- Сатарова Т.Н. Использование культуры пыльников для получение гаплоидов у кукурузы // Кукуруза и сорго. – 2001. – №4. – С.21 – 23.
- Сатарова Т.М. Андрогенез та ембріокультура у кукурудзи invitro.Дис… доктора біол. наук. – Дніпропетровськ, 2002. – 537 с.
- Суханов В.М., Клочков В.П., Хохлов С.С., Тырнов В.С. Использование культуры пыльников для получения гаплоидов / Труды II Всесоюзной конференции культура клеток и тканей. – К.: Наукова думка. – 1978.– С.312 – 314.
- Шевелуха В.С., Калашникова Е.А., Воронин Е.С. и др. Сельскохозяйственная биотехнология. – М.: Высшая школа, 2003. – 469с.
- Genovesi A.D., Collins G.B. In vitro production of haploid plants of corn via anther culture // Crop Sci. – 1982. – V.22. – N 6. – P.1137 – 1144.
- Ting Y.C., Yu M., Zheng W.Z. Improved anther culture of maize (Zea mays) // Plant Sci. Lett. – 1981. – V.23. – P.139 – 145.
Автор статьи: Ляпустина Е.В.
Авторы фото в статье: первое и третье — Сатарова Т.Н., второе — Ляпустина Е.В.