Основным индуктивным средой культуре зерновок была среда MS. Различные модификации этого базового среды представлены в описаниях соответствующих экспериментов. При изучении влияния консистенции питательной среды применяли YP жидкое (YРрид.) и YP pol. за S.Pescitelli et al. (1989).
Все поставленные эксперименты и сформулированные вопросы, Должны быть изучены для всех генотипов особенно модельных и тех, Которые характерны для данной местности. В экспериментах использовались разные генотипы. Это, в первую очередь, связано с тем, что они все являются в своем роде модельным и требуют изучения, а также с невозможностью поставить все эксперименты на одном генотипе одновременно (в одно лето), из-за отсутствия большого количества одинаковых делянок.
В задачи наших исследований входило исследование роста и развития завязей, семязачатков и зародышей генетически различных объектов in vivo и in vitro.
Наблюдение за морфологическими изменениями проводили с помощью использования микроскопа МБС-9. Для выполнения условий физиологической полярности зародыши на питательную среду эксплантируются щитком к среде (Калинин, 1980).
Разрабатывая методику выращивания изолированных зародышей на различных питательных средах, использовали незрелые и зрелые зерновки генотипов кукурузы. Затруднения при выращивании заключались в отсутствии данных о составе искусственного питательной среды и условий культивирования и трудоемкости работы по изоляции зародышевых мешков незрелых зерновок. Для изоляции же незрелых или несостоявшихся зародышей является методика по замачивании зерновок кукурузы течение 15 часов при 3-5°С (Клейн, 1974). Необходимость присутствия сахарозы для эмбриогенеза экспериментально доказана как для кукурузы, так и для других культур (Тюкавин, 2007). Исследование влияния цитокинина на эмбриогенез было начато с открытия Скуга и Миллера (Skoog, Miller, 1957) кинетина.
В целом на основе исследований, проведенных в 2008 — 2009 гг, должны отметить, что при культивировании на питательных средах in vitro оплодотворенных генеративных органов кукурузы, растения можно получать из разновозрастных семязачатков, зародышевых мешков и зиготических зародышей.
Работа в культуре, исследование процесса стерилизации посадочного материала. Варианты:
- 96° спирт в обертке обмыть, 3 раза промыть дистиллированой стерильной водой
- 96° спирт+сулема (0,5гр на 1л воды дист. 0,5% сулема) в обертке, 3 раза промыть дистиллированой стерильной водой
- 70° спирт в обертке, 2 раза промыть дистиллированой стерильной водой
- 70° спирт+сулема (0,5% сулема) в обертке, 3 раза промыть дистиллированой стерильной водой
- 70° спирт без обертки и рылец, 2 раза промыть дистиллированой стерильной водой
Результаты. Во время исследования стерильности культуры зерновок при различных способах поверхностной стерилизации кукурузы экспланты высаживались на 9 см чашки Петри, по 10 зерновок на одну чашку.
На один вариант высаживалось по 50 эксплантов. Анализ проводился визуально ежедневно, культивирование продолжалось до 50 дней в культуре. В результате была получена 100% стерильность во всех испытуемых вариантах. Но отмечено визуально более агрессивное поведение таких стерилизующих агентов как 96° спирт и 0,5% раствор сулемы, які викликали ураження верхніх тканин матеріалу. Поэтому в дальнейших проведенных исследованиях был использован вариант с 70°спиртом– як найбільш м’який. При культивировании других эксплантатов, генотипов инфекция проявлялась, но она не была системной и не зависела от выбранного варианта поверхностной стерилизации. Однако при работе с более поздними эксплантатами использовалась поверхностная стерилизация початка 70°спиртом без обложек, на протяжении 10 минут. Это было связано с появлением вредителей и заболеваний на испытуемых початках кукурузы, которые проявляются при более поздних сроках созревания в полевых условиях.
Эксплант и условия: линия DAP= 5, среда NBM: MS витамины, N6 макросоли, B5 микросоли, % BAP, Fe-хелат, 9% сахароза, 7% агар-агар, культивирование при отсутсвии света, температура 23°С, анализ на DIC= 10, 20, 50.
Основой всех питательных сред для выращивания культур тканей растений является смесь минеральных солей (макро-и микроэлементов) и, поскольку питание культивируемых тканей является гетеротрофным, источник углерода включается в состав среды в виде сахарозы или глюкозы (Тюкавин, 2007; Божков, 2008).
Кроме углерода, кислорода и водорода, для роста тканей необходим азот в виде нитратной и аммонийной соли, фосфор — в виде фосфата; серая — в виде сульфата, а также ионы К +, Са2 + и Mg2 +. Общая концентрация всех минеральных элементов наиболее высока в средах Мурасинге и Скуга (Murashige, Skoog, 1962), Нича (Nitsch, 1969), Гамборга и Евелега B5 (Gamborg, Eveleigh, 1968), Шенка и Хильдебрандта (Schenk, Hildebrandt, 1972).
К настоящему времени разработано много сред для тканевых культур. Большинство из них относительно специфические, т.е. они предназначены для выращивания особых тканей. Другие среды имеют широкое применение и обеспечивают удовлетворительное рост эксплантов многих видов растений. До сих пор не существует общих указаний о том, какое из мест обеспечивает лучшее роста того или иного эксплантов. Сначала нужно подобрать какое-либо одно из обычных сред, а потом испытывать другие.
Принципы и теоретические основы создания питательных сред изложены в ряде монографий как зарубежных (Уайт, 1949), так и отечественных (Бутенко, 1964; Калинин и др., 1980) авторов. Мы рассмотрим влияние отдельных компонентов сред на культуру тканей и органов кукурузы.
Для приготовления агаризованных сред добавляют агар в концентрации 6 — 10 г / л. Величину рН среды обычно доводят до 5,5 — 6,0 перед автоклавированием (Тюкавин, 2007; Божков, 2008).
При разработке нового питательной среды для культивирования, А. Л. Гамборг (Gamborg et al., 1976) рекомендовал использовать в качестве контрольного — среда Мурасиге и Скуга (Murashige, Skoog, 1962), которое содержит достаточное количество питательных солей в благоприятных для роста соотношениях и вообще широко применяется, что до сих пор и применяется как универсальная среда.
Влияние возраста культивируемых незрелых зерновок на культуру in vitro. На среде NBM с 15% сахарозой и 1 мг / л БАП культивировали зерновки 1, 2 и 3-й суток после опыления.
Зерновки 1-х суток после опыления при культивировании 100% лопнули, 2-х суток — 9% лопнули, 3-х суток — 42,2% лопнули. Крахмал накапливался в основном одинаково интенсивно (+ +), в той части зерновки, которая прикасалась к среде, при этом как в лопнуть так и целых покровах. Зерновки на момент эксплантации примем как белые не набухли. При культивировании нуцеллуса потерял адгезию с тканями семязачатка и был одним целым обособленно, желтой окраски.
DAP = 1, DIC = 50: Длина нуцеллуса составила 2,93 ± 0,15 мм. Эндосперм не развивался, накопление крахмала и созревание зародышей не наблюдалось. 66,7% были желтые набухли, 33,3% были бури набухли. 26,7% зерновок высохли изнутри, были полностью пустыми Исследовано 15 шт.
DAP = 2, DIC = 50: Длина зерновки 3,84 ± 0,14 мм. В 2,0% зерновок произошло прорастание зародышей, при этом наблюдался развит эндосперм (размеры: оба по 3,5 мм), что накопил крахмал (+ +). В других 88,0% зерновках эндосперм не развивался, созревания зародышей не наблюдалось. 25,0% зерновок высохли изнутри, были полностью пустыми. Длина нуцеллуса составила 2,72 ± 0,43 мм. 64,0% бурых набухли зерновок (из них 2 шт., Содержащие дорощенный зародыш), 22,0% желтых набухли зерновок, 14,0% белых набухли зерновых. 3,0% зерновок содержали крахмал в покровах, 2% — в эндосперме, одновременно содержали крахмал в эндосперме и покровах 2% зерновых. Исследовано 100 шт. Установлено, что окраска зерновок после культивирования может служить маркерной признаку в развитие зародыша и накопления крахмала в эндосперме.
DAP = 3, DIC = 50: Длина зерновки 4,04 ± 0,21 мм. Длина нуцеллуса составила 2,46 ± 0,25 мм. 38,9% белых набухли зерновок, в 4-х зерновках накопился крахмал в покровах (+), 57,8% бурых зерновок, в 2-х зерновках накопился крахмал в покровах (+ +) и развился эндосперм (по 2 мм оба) и накопил крахмал (+ +), из них 4 шт. засохшие, желтых — 3,3%. Зародыш в одной зерновке не наблюдалось. Одновременно крахмал в 2,0% зерновых. Лопнуть — 42,2%, пустых — 27,8%. Установлено, что окраска зерновок после культивирования может служить маркерным признаком в развитие зародыша и накопления крахмала в эндосперме. Исследовано 90 шт. Содержит объединенные данные 1 +2 БАП (45 +45 = 90 зерновок).
На среде NBM с 12% сахарозой и 1 мг / л БАП культивировали зерновки 2 и 3-й суток после опыления.
На среде с 12% сахарозой не наблюдалось развитие эндосперма и зародыша.
DAP = 2, DIC = 50: Длина зерновки на среде с 12% сахарозой составила 4,16 ± 0,28 мм. Желтых набухших зерновок было — 17,6%, белых набухли — 27,0%, бурых набухли — 55,4%, полностью пустых изнутри — 48,7%. Длина нуцеллуса составила 2,59 ± 0,25 мм. Крахмал ни где ни накопился. 54,1% лопнуть зерновых. Исследовано 74 шт.
DAP = 3, DIC = 50: 4,60 ± 0,22 мм зерновка, 2,04 ± 0,18 мм нуцеллуса, 2,2% зерновок содержали развитый эндосперм с крахмалом (+) (2 мм), 2,2% зерновок содержали крахмал в покровах, одновременного не было. Белых — 15,6%, желтых — 24,4%, бурых — 60,1%, из них 3 засохшие. 48,9% лопнули, пустых не было. Исследовано 45 шт.
Влияние возраста культивируемых незрелых зерновок на культуру in vitro. На среде NBM с 15% сахарозой и 1 мг / л БАП культивировали зерновки 2-х суток после опыления генотипов 33х31 и 7356. Установлено, что генотип оказывает существенное влияние при культивировании зерновок с целью развитие эндосперма и зародышей. Вероятно, это связано с разным уровнем эндогенных гормонов и генетическим потенциалом вообще.
Длина зерновки, 1-х суток после опыления, на момент эксплантации составила примерно 2 мм, 2-х суток после опыления — 2,5 мм, 3-х суток после опыления — 3 мм. В полевых условиях длина зерновки, 21-х суток после опыления, составила 8,77 ± 0,32 мм. Показатель длины зерновок после культивирования подсчитывался для целых зерновок, которые не были лопнуть. Для лопнувших зерновок рассчитывался показатель длины нуцеллуса. Эксплантация зерновок была зародышем на среду. Основным питательной средой было модифицировано среду NBM по R. Mol, 1993. Модификацию проводили по концентрации сахарозы и 6-бензиламинопурину (БАП). Анализ проводили на 50-е сутки культивирования по морфометрических показателям.
Было проведено исследование по воздействию различной концентрации сахарозы на культуру незрелых зерновок in vitro. На среде NBM с 12%, 15% и 20% сахарозой и 1-2 мг / л БАП культивировали зерновки 2-3-х суток после опыления. (15С сутки 2, 1 БАП (74 шт), сутки 3: 1Б +2 Б (45 +45 шт.)), (12С сутки 3, 2Б (45шт) + сутки 2, 1Б (74шт))
Длина зерновки на среде с 12% сахарозой составила 4,32 ± 0,21 мм, с 15% — 3,92 ± 0,12 мм, с 20% — 3,38 ± 0,14 мм.
На среде с 12% и 20% сахарозой не наблюдалось развитие зародыша. На среде с 15% сахарозой в 1,1% зерновок произошло созревания зародыша, проросшие в зерновке. Снаружи зерновка наблюдалась дыра, прорастание происходило в среду (проросток был направлен к среде), увидеть это возможно при переворачивании чашки Петри или поднятием эксплантата.
На среде с 20% сахарозой не наблюдалось развитие эндосперма, с 12% — 0,8% зерновок содержали эндосперм, в котором накопился при этом крахмал. На среде с 15% сахарозой развитие эндосперма произошло в 2,1% зерновок (размеры 2 мм и 3,5 мм), все они содержали крахмал в эндосперме и одновременно и в покровах. Крахмал в покровах наблюдался в 4,2% зерновок, в том числе зерновки, содержащие эндосперм развит. Длина нуцеллуса была выше при концентрации сахарозы 15%.
Количество высохших зерновок из середины одинаково. Количество лопнуть зерновок уменьшалась с ростом концентрации, но рост зерновок, что происходило, было обратно пропорционально концентрации сахарозы, чем она больше, тем меньше была длина зерновки и наоборот. На среде с 20% сахарозой покровы были слишком толстые, по сравнению с другими вариантами концентраций сахарозы. Установлено, что окраска зерновок после культивирования может служить маркерной признаком доразвития зародыша и накопления крахмала в эндосперме. Так как эти процессы протекали в бурых зерновках. На средах с 12% и 15% сахарозой модальным классом окраску зерновок были бури, с 20% — расщепление по фракциям окраской между белыми, желтыми и бурыми было примерно одинаковым.
Таким образом, установлено, что концентрация сахарозы влияет на доразвитие зародышей и формирование эндосперма. Лучших результатов удалось добиться со средней концентрации сахарозы, так как созревание зародышей и образование эндосперма наблюдалось на среде с 15% сахарозой, развитие эндосперма наблюдалось также в среде с 12% сахарозой, но в меньшей степени при совместных других факторах: генотип, возраст, среда основное, БАП, продолжительность культивирования.
Автор статьи и фото в статье: Ляпустина Е.В.