Вы здесь

Эмбриокультура - культура зародышей

Средняя: 5 (1 оценка)
Эмбриокультура

Постгамная несовместимость при удаленной гибридизации возникает после оплодотворения. Часто при этом образуется невсхожие семяна. Причиной этому может быть расхождение во времени развития зародыша и эндосперма. При слабом развитии эндосперма зародыш бывает не способен к нормальному прорастанию. В этих случаях изолируют зародыш и выращивают его на питательной среде. Выращивание зародышей на искусственных питательных средах называется эмбриокультурой или культурой зародышей in vitro. Этот метод основан в 1904 г. Ханнигом. Культивирование in vitro зародышей предусматривает выращивание зародышей на специально подобранных средах в асептических условиях, предварительно изолированных из созревшего (нормально сформированного) семени, из недозрелого семени (на ранних стадиях развития). В первом случае зародыши полностью дифференцированы, во втором - они находятся в разных фазах развития [3, 4].

Практическое значение культуры зародышей, изолированных из созревших семян заключается в ускоренном получении растений из семян, плохо или совсем не прорастающих, а также в выведении зародыша из состояния покоя, который начинается еще во время созревания семян на растении. Состояние покоя зародыша может быть коротким, но иногда для его преодоления нужно применять специальные приемы воздействия на семена, такие как стратификация - действие пониженных температур или скарификация - повреждение кожицы твердого семени в целях повышения способности к набуханию для ускорения прорастания. В основном механизмы состояния покоя и прорастания семян зависят от освещения, температуры хранения, наличия эндогенных ингибиторов. В частности семена некоторых многолетних растений, размножающихся вегетативно, в естественных условиях не прорастают. Метод эмбриокультуры – культура зародышей используют для изучения, а также эффективного преодоления состояния покоя семян. Выращивание в стерильных условиях на искусственных питательных средах позволяет применять различные вещества для преодоления покоя и стимулирования роста зародыша [1].

Во время культивирования изолированных зародышей из созревшего семени обычно используют простую минерально-сахарозную среду без витаминов и регуляторов роста, поскольку биологически активные вещества часто вызывают появление ненормальных форм с искаженными отдельными органами и каллусообразованием [1, 3, 4]. Зародыши, как правило, выделяют из созревшего семени после набухания. Семена стерилизуют, иногда дополнительно обжигают в пламени спиртовки, а затем в стерильных условиях выделяют зародыши. Из сухих семян выделить зародыши труднее, но возможно, если этого требуют условия опыта или культивирования. Культивирование зародышей из созревших семян относительно несложное, поэтому может быть организовано в любой лаборатории биологического профиля.

Зародыши, изолированные на ранних стадиях развития с недозрелого семени или семенных зачатков сразу после оплодотворения, очень маленькие, имеют малые размеры органов, из которых они выделяются, поэтому их культивирования связано с определенными технологическими трудностями. Сложным является подбор питательной среды, которая должно обеспечить развитие зародыша до его нормального состояния в зрелом семени с последующим поддержанием прорастания и роста. Требования к физиологически активных веществам среды разные на разных стадиях развития зародыша. Так, комплексные органические добавки (эндосперм недозрелых кокосовых орехов, каштана или грецких орехов, злаков в стадии молочной спелости) нужны для созревания (дифференциации) зародыша. Однако после дифференциации последнего они могут вызвать ненормальное разрастание органов зародыша, поэтому его переносят на питательную среду другого состава.

Зародыши с недозрелого семени культивируют не только на поверхности агаровой полутвердой среды, но и в жидкой питательной среде, в атмосфере азота. Упомянутые выше условия культивирования зародыша подтверждают тот факт, что зародыш на разных этапах своего развития требует особых, характерных только для данного этапа, условий питания и других внешних факторов. В изолированной культуре выращиваются зародыши не только в стадии, когда преобладают процессы развития собственно зародыша, а и тогда, когда происходят процессы разделения только оплодотворенной яйцеклетки, например на очень ранней стадии 4-х клеток.

Культивирование очень малых, совсем не дифференцированных зародышей характеризуется рядом трудностей, которых можно избежать, выращивая семена зачатка с кусочками тканей, к которым они крепятся и за счет которых питаются (с плацентой). Для этого полностью культивируется завязь с плацентой и семяпочкой, которые впоследствии созревают до проэмбрио или зиготы [1]. Оптимальной длиной неспелого зародыша для получения хорошо развитых и быстрорастущих проростков кукурузы является 4,5 - 5 мм, что характерно зародышам на 14 - 18 суток после опыления в зависимости от условий выращивания [2].

Несмотря на трудности, связанные с выделением и выращиванием завязей из недозрелого семени, метод используется для отдаленных скрещиваний, в результате которых образуется нежизнеспособный зародыш. Если зародыш погибает не в результате генетических отклонений, а в результате несовместимости с эндоспермом, то культивирование зародыша на питательной среде позволяет получить ценные гибридные растения. Таким образом, получены межродовые и межвидовые гибридные растения.

Метод культуры незрелых зародышей зачастую используется тогда, когда невозможно эффективно получить определенную генетическую комбинацию желаемых признаков традиционными методами. В основном барьер несовместимости при развитии гибридного зародыша возникает на средних и поздних стадиях эмбриогенеза. Обычно это проявляется в нарушении развития эндосперма или полном его отсутствии, что приводит к гибели зародышей. Специально подобранный состав компонентов питательных сред для культивирования незрелых зародышей предоставляет все необходимые вещества для нормального развития зародыша и, таким образом, заменяет эндосперм.

Важнейшим требованием при работе с изолированными зародышами является выбор питательной среды, способной поддерживать их рост и развитие. Несмотря на то, что состав питательных сред изменяется в зависимости от вида культивируемых зародышей, очевидно, что чем моложе зародыш, тем выше требования к составу питательных сред. Например, если относительно зрелые зародыши можно выращивать на средах только с добавлением солей и сахарозы, то для нормального развития зародышей, изолированных на ранних стадиях, необходимые витамины, аминокислоты, фитогормоны, а также сложные комплексные добавки в виде экстракта дрожжей, гидролизата казеина, кокосового молока и т.д. Рекомендуется также добавление маннитола и других компонентов, обеспечивающих оптимальное осмотическое давление, необходимое для правильного развития зародыша. Полученные гибридные растения доращивают в условиях теплиц [1]. Экспериментально было доказано, что лучшими режимами для проращивания неспелых зародышей кукурузы следует считать 27оС круглосуточно и 27оС в день и -150С ночью, в зависимости от генотипа [2]. Что касается оптимизации состава питательной среды, доказано, что введение в его состав 2,5 г / л активированного угля не отражалось на прорастании, но позволило при приготовлении среды получать более стабильные значения рН [2]. Эта мера позволила независимо от марки агара получать хорошее развитие корневой системы и без повреждений выделять проростки из пробирок и пересаживать в грунт. При необходимости стимулировать прорастание молодых (12-суточных) зародышей следует использовать 1 мг / л 6-БАП [2].

Кроме преодоления нежизнеспособности незрелых зародышей метод эмбриокультуры важен для решения других проблем, в частности получения линий и сортов растений, старые семена которых почти утратил свою жизнеспособность, но одновременно растения очень важны для определенной селекционной программы. В последнее время большое значение приобретает применение эмбриокультуры – культуры зародышей в селекции для получения удаленных серверов гибридов сельскохозяйственных культур [1].

Если гибридные зародыши абортируют на ранних стадиях развития, то изолирование их и культивирование в условиях in vitro не имеет положительных последствий. Нормальное развитие эмбрионов в этом случае возможно из изолированных семенных зачатков. Основные преимущества этого метода в том, что состав питательных сред проще, чем в случае культивирования незрелых зародышей. Более того, семенные зачатки выделяются гораздо легче, чем незрелые зародыши.

Кроме того, метод эмбриокультуры – культуры зародышей позволяет проводить отбор устойчивых к болезням растений на раннем этапе их развития при условии, что реакция взрослого растения совпадает с реакцией проростков, полученных из зародышей [1].

Используя метод эмбриокультуры – культура зародышей для исследования зависимости развития зародышей растения-хозяина и паразита, можно культивировать семена и эмбрионы некоторых облигатных паразитов в асептических условиях in vitro. Таким образом, знание методов прорастания семян и роста эмбрионов, а также их чувствительности к различным компонентам питательной среды способствует установлению контроля над развитием паразита и растения-хозяина с помощью соответствующих химических средств или поиска таких форм растений, которые являются антагонистами паразита.

Применение метода эмбриокультуры – культура зародышей позволяет даже в условиях отсутствия полноценного искусственного климата при минимальных затратах получать дополнительные генерации и в этот способ ускорять селекционный процесс, при переводе линий кукурузы на цитоплазматическую мужскую стерильность [2].

Список литературы

  1. Мельничук М.Д., Новак Т.В., Кунах В.А. Біотехнологія рослин: Підручник – К.: ПоліграфКонсалтинг, 2003. – 520с.
  2. Сатарова Т.М. Андрогенез та ембріокультура у кукурудзи in vitro .Дис… доктора біол. наук. – Дніпропетровськ, 2002. – 537 с.
  3. Шевелуха В.С., Калашникова Е.А., Дегтярев С.В., Кочиева Е.З., Прокофьев М.И. и др. Сельскохозяйственная биотехнология. – М.: Высшая школа, 1998. – 416с.
  4. Шевелуха В.С., Калашникова Е.А., Воронин Е.С. и др. Сельскохозяйственная биотехнология. – М.: Высшая школа, 2003. – 469с.

Автор статьи и фото (зародыши кукурузы, полученные in vitro) в статье: Ляпустина Е.В.

Добавить комментарий