Методы изоляции клеток, оплодотворения in vitro и другие техники микроманипуляций в сочетании с высоко чувствительными аналитическими методами являются удачными инструментами для изучения процессов оплодотворения и раннего развития семян у цветковых растений (Kranz, 2008). Процесс оплодотворения может быть исследован в живом зародышевом мешке, как на растении, так и в пробирке. Этот подход требует создания искусственных условий подобно естественным для обеспечения управления зародышевым мешком и клетками спермиями в течение оплодотворения. Это позволило бы преодолеть несовместимость и создать новые виды зерновых культур растений. Также это позволит получать трансгенные растения в пробирке, путем введения трансгенных спермиев в зародышевые мешки или трансгенов в оплодотворенный зародышевый мешок. Изолированные условия позволят исследовать ранние этапы развития зародыша и эндосперма, что является затрудненным на растении. Также позволит исследовать влияние клеток нуцеллуса как стимула для эмбриогенеза на ранних этапах развития, при культивировании зародышевых мешков с тканями нуцеллуса или полностью изолированном состоянии. Таким образом, исследование частично или полностью изолированных структурных элементов женского гаметофита позволит получить максимально полную информацию на клеточном, генетическом и биохимическом уровне. Это будет способствовать пониманию процессов развития семян и совершенствования урожая зерновых.
Спермии покрытосеменных нуждаются в изоляции от пыльцевых зерен или труб. Для этого применяют рН-шок, сплющивание и размалывание триклеточных пыльцевых зерен или двоклеточной пыльцы из труб (Сатарова, 2006; Kranz, 2008).
В цветочных растениях женские гаметы (яйцеклетка и центральная клетка) находятся в зародышевом мешке, глубоко погруженные в ткани семязачатка. Это затрудняет манипуляции с ними (Leduc, 1995, Лаурие, 1999; He, 2004; Punwani, 2008; Higashiyama, 2008; Marton, 2008). Яйцеклетка и центральная клетка у однодольных (maize, wheat, rice) достаточно велики для изоляции ручными средствами и использования в исследовании выше указанных процессов. Ограничения существуют лишь при изоляции и манипуляции с яйцеклетками двудольных (Arabidopsis, Brassica), из-за их относительно малых размеров и трудности при морфологическом различении от других клеток семязачатка. Альтернативой в данном случае может быть лазерный микроразбор и использование линий, отражающих GPF-экспрессию исключительно в яйцеклетке или центральной клетке, что позволило бы определить местоположение этих типов клеток и их отбор под epifluorescent светом (Kranz, 2008).
Изоляция жизнеспособных зародышевых мешков представляет большой потенциал для исследования процессов оплодотворения, эмбриогенеза и эндоспермиогенеза (Laurie, 1999). Для этого применяют ферментативную мацерацию тканей нуцеллуса, механический разбор вручную или с помощью микроманипуляторов и комбинацию этих вариантов (Wagner, 1989; Kranz, 2008). Предложено нарезать изолированную зерновку кукурузы по 250-300 мкм на секции, содержащие покровы, ткани нуцеллуса и зародышевый мешок, который хорошо прослеживается внутри (Laurie, 1999). С таким секциям легко проводить манипуляции, используя щипцы и не касаясь зародышевого мешка непосредственно, контакт идет через покровы и ткани нуцеллуса. Данная процедура изоляции не требует ферментативного вмешательства, т.е. не материальнозатратна и не столь длительная и трудоемкая как механическая изоляция вручную или с помощью микроманипуляторов. Но требует специально аппаратурного оснащения (Vibratome).
Ферментативную обработку первыми применили Zhou и Yang в 1985 году. При изоляции остро стоит вопрос долгосрочной жизнеспособности и развития изолированных зародышевых мешков. Ферментативное вмешательство затрагивает дальнейшую жизнеспособность зародышевых мешков и доращенных в них зародышей [Leduc, 1995; Wagner, 1989; Campenot, 1992; Matthys-Rochon, 1994; Laurie, 1999; He, 2004; Zhao, 2000] и не может одновременно удовлетворить потребности для нормального развития и средств для микроманипуляций. Для кукурузы описана культура изолированных вручную зародышевых мешков, содержавших несколько слоев клеток нуцеллуса (Mol R, 1993; Campenot, 1992). Также есть свидетельства о сочетании методов изоляции вручную и применения ферментативной обработки для кукурузы (Leduc, 1995; Wagner, 1989; Matthys-Rochon, 1993, 1994) и других цветочных растений (He, 2004). Наиболее полное удаление клеток нуцеллуса с поверхности зародышевого мешка возможно только при ферментативном вмешательстве. Оптимальной методики, которая давала бы полностью удовлетворительные результаты не существует. Более ранние исследования в этой области предусматривали ферментативную мацерацию от 30 минут до нескольких часов (Matthys-Rochon, 1994; Wagner, 1989; Huang, 1992). Но даже при применении ферментов в меньшей концентрации и экспозиции (2 минуты для кукурузы) (Leduc, 1995) существует негативное влияние на дальнейшую жизнеспособность зародышевых мешков, подлежащих обработке. Зародыши, полученные по такой методике, были малы, неправильного строения, с ограниченным органогенезом и при последующей регенерации не давали растений. Существует несколько мнений на этот счет. Основной проблемой культивирования на искусственной питательной среде является наиболее полное воссоздание условий in vivo.
Более полное удаление клеток нуцеллуса с поверхности зародышевого мешка после ферментативной обработки могло удалить одновременно и важные стимулы для раннего зародышевого развития, обеспечиваемых присутствием в культуре in vitro тканей материнского организма (нуцеллуса) [Leduc, 1995; Laurie, 1999]. Ткани нуцеллуса могут нести вклад в передачу питательных веществ или действовать как буфер между средой и зародышевым мешком [Campenot, 1992]. Но зиготический эмбриогенез кукурузы было получено без сопроводительных тканей материнского организма и тканей эндосперма после электрослияния гамет (Kranz, 2008). Ферментативная обработка может затрагивать компоненты клеточной стенки самого зачаточного мешка и вызвать вредные изменения в межклеточных связях и передаче сигналов, тем самым нарушить нормальный ход эмбриогенеза [Wagner, 1989]. Есть свидетельства о том, что зародышевые мешки после обработки раствором ферментов теряли первоначально форму, составляющие клетки были несколько отдаленными [Wagner, 1989; Huang, 1992], зигота приобрела округлую форму (Leduc, 1995) вместо грушевидной как на растении (Mol R, 1994).
Растворение ферментов и их смыв проводят с помощью жидкой питательной среды, в которой происходит непосредственно культивирование зародышевых мешков (Leduc, 1995; He, 2004) или в 9% растворе сахарозы [Wagner, 1989]. Это необходимо для поддержания давления в клетке на соответствующем уровне, из-за возможности деформации клетки или разрушение ее целостности вообще, из-за вымывания или избытка воды соответственно. Это связано с разницей плотностей, которая может возникать при применении воды как растворителя и средства для смывания раствора ферментов.
Если не разработать оптимальную методику изоляции зародышевых мешков с помощью ферментов, то окажется, что эти средства дают ограниченные перспективы для долгосрочных исследований, где существует потребность нормального эмбрионального развития. Выбор подходящего метода изоляции зависит от требований, предъявляемых к зародышевым мешкам. Это либо долгосрочная жизнеспособность, с последующей регенерацией растений, или максимальное удаление клеток нуцеллуса с поверхности зародышевого мешка для проведения генетических манипуляций. Альтернативой могут стать исследования в условиях in vitro культуры зерновок (Ляпустіна, 2010) и слияние изолированных гамет (Kranz, 2008).
Автор статьи и фото в статье (кроме последнего): Ляпустина Е.В.
Автор последнего фото в статье: Сатарова Т.Н.