Как правило, выбор питательной среды определяется различными факторами. Успех в развитии тканевой культуры во многом зависит от того, какой тип среды (жидкую или агаризированную) применяли для культивирования. Одни и те же виды растений могут нуждаться в различных формах среды в течение разных фаз развития.
Исследования проводятся с ограниченным количеством клеточных штаммов, полученных от различных растений. Видимо, не будет большим преувеличением считать, что перевод культуры каллусной ткани в жидкую питательную среду и получение стабильной клеточной популяции при глубинном выращивании приводят к качественно новому состоянию растительных клеток. На это указывают увеличение скорости роста и продуктивности стабилизировавшихся суспензионных культур клеток (Саркисова, 1973), изменение межклеточных взаимодействий (Noguchi et al., 1977), приспособление к изменившимся условиям газового режима и др.
Можно предположить, что с первых же минут цикла периодического выращивания клеточная популяция находится в стрессовом состоянии вследствие резкого изменения условий существования. Об этом свидетельствует трехкратное увеличение дыхания клеток. Вероятно, в это время происходит запуск механизмов синтеза мРНК, белка, ДНК, реализуемых в лаг-фазе (Маркова и др., 1979). Лаг-фазу определяют как процесс адаптации клеточной популяции к новым условиям роста (Бутенко, 1981). Ее длительность зависит от количества и физиологического состояния инокулята, а также состава питательной среды, газового режима и условий перемешивания.
Обычно для получения культуры клеток высших растений используется культура каллусной ткани. Успех работы во многом зависит от того, насколько удачно выбрана или подготовлена каллусная ткань, которая должна быть рыхлой, легко распадающейся на небольшие клеточные агрегаты и клетки. Для получения культуры клеток берется наиболее жизнеспособная, пролиферирующая часть каллусной ткани, а ее количество должно быть в 1,5-2 раза больше (с учетом объема питательной среды), чем при серийном субкультивировании на агаре. Если каллусная ткань недостаточно рыхлая, то необходимо разделить ее на небольшие кусочки диаметром около 3-4 мм. Питательная среда может быть та же, что и при культивировании ткани на агаре, но в некоторых случаях увеличивают концентрацию ауксинов и/или уменьшают концентрацию цитокининов. Режим перемешивания и аэрирования при инициации культуры клеток обычно такой же, как и при дальнейших ее серийных субкультивированиях на роллерах и качалках.
Образование первичной суспензии растительных клеток можно считать результатом трех процессов: распада части каллусной ткани на клетки и небольшие клеточные агрегаты в момент внесения в жидкую питательную среду; отделения клеток и клеточных агрегатов с поверхности кусочков ткани в течение первых субкультивирований; деления и роста клеток в результате первых двух процессов и распада разрастающихся клеточных агрегатов на более мелкие агрегаты и клетки. Последний процесс типичен для роста стабилизировавшейся культуры клеток высших растений. С накоплением информации о стабильности статистического распределения отдельных клеток и клеток в агрегатах, характере роста в агрегатах и их форме эти показатели можно будет использовать как важные признаки штаммов. При первых субкультивированиях, даже в случае использования рыхлой каллусной ткани, необходимо избавиться от крупных агрегатов (Бутенко, 1981).
Изменения клеток in vitro аналогичны возрастным состояниям растительной клетки in vivo. Так, молодые клетки меристематической зоны корня после ряда делений достигают зоны растяжения, выходят из цикла делений и увеличиваются в размерах. С возрастом, все более дифференцируясь, они приобретают специфику окружающих их растительных тканей (Иванов, 1974). Разнообразие дифференцированных элементов в растительной культуре in vitro не так велико, как в растении. Несомненно, что отсутствие коррелятивных связей интактного растения, а также условия культивирования сказываются на морфологии и размерах клеток. Одним из таких факторов является состав среды (Фролова, 1981; Кунах, 2005).
Для растительных клеток in vitro характерна изменчивость формы, размеров и структуры ядер. Эти изменения связаны с изменениями размеров клеток и плоидности ядер. Растительные клетки in vitro, как правило, содержат одно ядро и делятся митотически. Величина клетки зависит также от ее возраста: стареющие клетки могут достигать гигантских размеров (500-1000 мкм), в то время как размеры молодых каллусных клеток небольшие – 15-30 мкм (Бутенко, 1975). Такая морфологическая гетерогенность может быть следствием условий культивирования, видовых особенностей, возраста и уровня плоидности клеток.
Вопрос о стабильности цитогенетической характеристики в растительных клетках in vitro очень важен, так как эти ткани широко используются в качестве модельных объектов и имеют прикладное применение. Поэтому к ним предъявляется ряд требований, таких, как стабильное сохранение уровня плоидности, отсутствие цитологических нарушений, гомогенность состава не только генетическая, но и физиологическая.
Говоря о культивировании растительных тканей на жидких питательных средах, необходимо отметить, что обычно первичные экспланты культивируют на авизированных, реже – жидких питательных средах. Последние часто, но не всегда имеют определенные преимущества перед агаризированными, так как в них обеспечивается большая подвижность трофических элементов, их можно частично или полностью изменять в процессе культивирования.
Среди других особенностей культивирования отметим стимуляцию развития эксплантов некоторых видов растений при культивировании их на жидких или комбинированных питательных средах. Перемешивание жидких сред осуществляется с помощью специальных аппаратов – роллера, шейкера, ротора, качалки – в вертикальном или горизонтальном направлении. Количество оборотов различно (от 0,5 до 200 об/мин) и определяется каждым исследователем индивидуально.
G. Morel (1960) выращивал меристематические ткани Cymbidium на твердой среде. Однако проведенные в последующем многочисленные исследования показали, что жидкие среды более эффективны для индукции каллуса и протокормов. Жидкие среды для выращивания меристем Cymbidium и других орхидных впервые предложил D. Wimber. Результаты его исследований показали, что встряхивание (или перемешивание) способствует образованию многочисленных центров роста, т. е. тормозит (офаничивает) полярность развивающейся ткани и тем самым ингибирует развитие побегов.
Жидкие среды способствуют также хорошей аэрации и поглощению поверхностного кислорода. Кроме того, в них более равномерно распределяются питательные вещества и растворяются токсические метаболиты. Применение жидких сред увеличивает поверхность контакта ткани и питательной среды, обусловливая активизацию дыхания, а также благоприятствует синтезу белка и поглощению солей. Можно успешно выращивать меристемы Cymbidium в жидкой питательной среде Кнудсона, получая большое количество протокормов. Сформировавшиеся протокормы затем переносят на твердую среду, на которой происходит регенерация растений. Таким образом, можно удачно сочетать две формы питательной среды.
Этот способ культивирования меристематических тканей орхидных применяли в дальнейшем многие исследователи. Добавление НУК и вращение со скоростью 5 об/мин способствовало образованию многочисленных протокормов Cymbidium.
Особо следует сказать о влиянии pH в жидких питательных средах. Твердые, агаризированные среды обычно не изменяют pH, а если сдвиги и происходят, то они, как правило, незначимы. pH жидких питательных сред меняется довольно быстро, что выражается в потемнении среды и появлении некрозов, а иногда и гибели меристематических тканей. В этом случае среду либо заменяют, либо переносят ткани в другие сосуды на новую питательную среду. Поэтому жидкие среды требуют более тщательного контроля pH, чем твердые.
Источник: Биотехнология тропических и субтропических растений in vitro