Оптимизация методов введения в культуру in vitro некоторых ягодных культур – смородины чёрной (Ribes nigrum L.), смородины красной (Ribes rubrum L.) и крыжовника (Ribes uvacrispa L.)
В настоящее время вопрос о микроклональном размножении новых сортов смородины чёрной, смородины красной и крыжовника остается недостаточно изученным, о чём свидетельствуют немногочисленные литературные сообщения по этой теме и дефицит оздоровленного посадочного материала вышеназванных культур. Как известно, первым этапом и необходимым условием микроклонального размножения ягодных культур является перенос в стерильных условиях эксплантов с маточных растений на соответствующую питательную среду с последующей активацией на эксплантах роста тканей изолированных меристем.
Материалом исследований были: сорта смородины чёрной – Санюта, Софиевская и Юбилейная Копаня; красной порички – Выборова, Святомихайловская и Троицкая; крыжовника – Каменяр, Кий, Неслуховский, Черномор. Целью работы было выяснить оптимальные сроки отбора побегов, режим их стерилизации и какой исходный растительный материал наиболее подходит для получения стерильной культуры. Работа проводилась в период с 2004 г по 2008 г. Методической основой в наших исследованиях была работа Циммермана (Zimmerman, 1984), модифицированная сотрудниками Института садоводства УААН (Бартиш и др., 1994; Тітаренко та ін., 2005).
Для введения в культуру in vitro cнеповрежденных маточных кустов отбирали однолетние побеги: древесные – когда растения уже вышли из состояния глубокого покоя (в марте); этиолированные (I), полученные с помощью бумажных изоляторов (в апреле) или (II) из проросшего в темноте посадочного материала (в апреле-мае); и активно вегетирующие зеленые побеги (в мае-июле). Древесные черенки на протяжении 2-х часов отмывали в воде со стиральным порошком «Лотос», затем один час промывали в проточной воде. Очищенные от загрязнения черенки стерилизовали в растворе нитрата серебра (0,3%) в течение 10 мин с последующим 3-х кратным промыванием в стерильной дистиллированной воде по 5 мин в каждой порции. Стерильные черенки нарезали на экспланты с одной почкой – апикальной или латеральной и высаживали в пробирки со стерильной агаризованной средой Мурасиге-Скуга (МС), в которой было уменьшено вдвое содержание макросолей и сахарозы (или глюкозы), и содержалось 0,3 мг/л бензиламинопурина (БАП) и 0,1 мг/л индолилмасляной кислоты (ИМК). При введении в культуру in vitro проросших вегетативных почек зеленых и этиолированных черенков значительно уменьшали длительность воздействия моющего раствора и стерилизующего реагента для предотвращения в дальнейшем некротизации тканей эксплантов и интенсивного выделения ими фенольных веществ в питательную среду. Зеленые черенки отмывали в моющем растворе 30 мин, промывали в проточной воде 30 мин и стерилизовали в AgNO3 5-10 мин. Этиолированные черенки – соответственно 20, 20 и 3-5 мин. Размеры эксплантов, высаженных на питательную среду, были 10-15 мм. В настоящее время с помощью электронной микроскопии уже доказано, что эффективность использования культуры апикальной меристемы (размеры апексов 0,2-2 мм) как метода оздоровления растений от вирусов достаточно низкая (Митрофанова и др., 1997). Кроме того, экспланты с размерами меньше 0,2 мм, характеризуются сниженной регенерационной способностью (Кушнір і Сарнацька, 2005).Через 2-3 нед стерильные экспланты пересаживали на свежую питательную среду для микроклонального размножения – МС с содержанием 0,3-0,5 мг/л БАП и 0,1-0,3 мг/л ИМК. Культивирование осуществляли в контролируемых условиях культуральной комнаты: освещенность – 2-3 клк, фотопериод – 16 ч, температура – 18-24˚С, влажность – 60-80%.
Чёрная смородина характеризовалась практически одинаковой эффективностью введения в in vitro для всех видов побегов (древесных, зеленых, этиолированных) – было получено около 20% стерильных эксплантов с проросшими почками. При этом наименее трудоемкими были процессы получения стерильных эксплантов с использованием зеленых и этиолированных черенков (II), полученных в результате прорастания в темноте посадочного материала. Наименьший процент заражения эксплантов грибной и бактериальной инфекцией был отмечен у сорта Санюта.
Для красной смородины было характерно получение очень низкого процента стерильных жизнеспособных эксплантов из древесных черенков: у Выборовой и Троицкой – 3, у Святомихайловской – 0%. С помощью зеленых черенков удалось значительно повысить процентное содержание стерильных сегментов с почками у сортов Выборова и Троицкая (до 15-20%). В случае использования этиолированных черенков у всех исследуемых сортов было получено около 15% стерильных эксплантов с проросшими почками.
Крыжовник характеризовался еще более сложной картиной получения стерильной культуры. Применение древесных, зеленых и этиолированных побегов (I) только у одного сорта Каменяр позволило получить небольшое количество стерильных жизнеспособных эксплантов (3%). Однако при использовании этиолированных побегов (II) посадочного материала у всех сортов удалось получить около 25% стерильных, впоследствии проросших эксплантов.
На наш взгляд, существенная разница в инфицировании первичных эксплантов, полученных из древесных и зеленых черенков у чёрной смородины, красной порички и крыжовника обусловлена особенностями анатомического строения коры и эпидермиса их побегов, которые даже визуально существенно отличаются друг от друга, как по культурам, так и по сортам.
Известно, что первичные экспланты исследуемых нами ягодных культур при неблагоприятных условиях в in vitro могут интенсивно выделять фенольные вещества в питательную среду, в результате чего эксплант может погибнуть. Минимализации выделения фенолов способствует ряд факторов: уменьшение вдвое количества макросолей и углеводов в питательной среде; понижение интенсивности освещения (1 клк) и температуры (18-20˚С) воздуха в культуральной комнате; правильный выбор времени стерилизации в AgNO3 (3-5, 5-10 мин); частые пересадки (через 1-2 дня) на свежую питательную среду.
Следует отметить, что при использовании древесных черенков прорастали преимущественно верхушечные (85%) и в значительно меньшей мере боковые меристемы. Если в культуру вводили с помощью зеленых и этиолированных черенков, то прорастали в равной степени, как апикальные, так и латеральные меристемы.
Таким образом, смородина чёрная достаточно легко вводится в культуру in vitro в отличие от порички красной и крыжовника. Введение в культуру смородины чёрной можно проводить на протяжении длительного времени (март-июль) с помощью древесных, зеленых и этиолированных черенков. Красную смородину и крыжовник наиболее эффективно вводить в культуру этиолированными черенками, полученными из проросшего в темноте посадочного материала (в апреле-мае). Введение в in vitro эксплантов этиолированных черенков посадочного материала является наименее трудоемким и наиболее эффективным методом получения стерильной культуры смородины чёрной, смородины красной и крыжовника.
Источник: Оптимизация методов введения в культуру in vitro некоторых ягодных культур – смородины чёрной (Ribes nigrum L.), смородины красной (Ribes rubrum L.) и крыжовника (Ribes uvacrispa L.) / Титаренко Т.Е. // Біотехнологія. Наука. Освіта. Практика: тези доповідей IV Міжнародної науково-практичної конференції (Дніпропетровськ, 11 – 13 листопада 2008 р.) – Дніпропетровськ, 2008. – С. 174-175.