Культура зерновок как биотехнология культуры зародышей кукурузы in vitro

Культура изолированных зерновок как биотехнологическая система доращивания зиготических зародышей кукурузы in vitro

Установлена возможность получения жизнеспособных зародышей полной зрелости в культуре изолированных зерновок кукурузы на искусственной питательной среде в условиях in vitro от зиготы / проэмбрио и глобулярной стадии. Установлен факт накопления крахмала в эндосперме при культивировании на искусственной питательной среде. Внутреннее состояние зерновки может служить маркерным признаком созревания зародышей и накопления крахмала в эндосперме независимо от генотипа. Генотип, возраст культивируемых зерновок и концентрация сахарозы влияют на развитие эндосперма, накопление в нем крахмала и доращивание зародышей от зиготы / проэмбрио и глобулярной стадии.

Введение

Развитие в культуре in vitro элементов мужской и женской генеративной сферы от ранних этапов до зрелости, предусматривающие культивирование на искусственных питательных средах, является многообещающим направлением для моделирования и объяснения процессов регенерации растений [9]. Широко распространенными являются исследования in vitro культур зигот, зародышевых мешков и зародышей [3]. Эти элементы представляют большой интерес для широкого круга генетических манипуляций, а именно: изолирование гамет, их слияние, доращивание полученных зигот и изолированных зародышевых мешков, содержащих зиготу или проэмбрио, доращивание изолированных незрелых зародышей. Процедура изоляции элементов зерновки трудозатратная, долговременная и требует применения ферментов, дающих ограниченные перспективы для использования изучаемых объектов, из-за их сомнительной жизнеспособности [1, 5, 16]. Условия во время культивирования должны максимально приближаться к условиям на растении. Поэтому проводят культивирование с частью ткани материнского или отцовского организма для длительного роста [6]. Условия развития эндосперма и зародышей не совпадают, каждый из них требует особых условий культивирования [4, 8]. У кукурузы положительных результатов получено при культивировании оплодотворенных зародышевых мешков с тканями нуцеллуса, покровами семян [1, 15]. Для табака, пшеницы и риса использовали яйцеклетки при культивировании изолированных зигот [5, 14, 17].

Изолированные зерновки являются удачным объектом для исследования факторов, существенно влияющих на регенерационные процессы у растений. Выяснению подлежат: влияние генотипа и возраста культивируемых объектов, продолжительность культивирования, установления оптимальной концентрации углеводов и фитогормонов, необходимость применения субкультуры и прочее. Культивирование целых зерновок позволит более детально изучить физиологию развития эндосперма, зародыша и зерновки в целом. Путями исследования могут быть эмбриологические и метаболические направления, то есть как с точки зрения формирования и развития эндосперма, зародыша, так и с точки зрения углеводородного и азотного обмена веществ. Культура зерновок кукурузы, изолированных от початка в условиях in vitro до сих пор не изучалась. В культуре in vitro зерновки кукурузы с сегментами початка были использованы в исследованиях по углеводородному и белковому метаболизму [2, 12, 13]. В условиях in vivo в изолированных зерновках было исследовано крахмало-липидный баланс [10].

Выбор питательной среды достаточно важен, он указывает на способность и компетентность системы in vitro. Среда влияет на развитие эксплантатов, не только обеспечивая условия для развития, но и влияет на возможность ускорения развития исследуемых объектов. Базовой и универсальной средой для многих видов растений, разного возраста, разного типа эксплантатов является среда Мурасиге-Скуга. Но универсальное не значит лучше. Остается проблема оптимизации питательной среды для каждого вида растений и для каждого случая отдельно.

Во время культивирования изолированных объектов различных генотипов могут отсутствовать различия относительно времени первого деления зиготы, и на первый взгляд выбранные генотипы имеют равные вероятности развития. Но главное отличие заключается в потенциале зиготы при дальнейшем развитии и образовании многоклеточных структур. Генотип влияет на возможность развития зиготы по пути прямого эмбриогенеза, образования каллуса или нескольких зародышей из одной зиготы. Есть свидетельства о влиянии генотипа на культуру зигот табака [5], риса [11], пшеницы [7]. Несмотря на наличие свидетельств, о важности влияния генотипа в процессе культивирования растений, этому вопросу, у кукурузы, было уделено недостаточно внимания. Возраст культивируемых объектов также имеет существенное влияние на дальнейшее развитие. Это может быть связано с уровнями эндогенных гормонов, состав которых в разном возрасте разный. В этой связи существует необходимость оптимизации состава питательной среды в соответствии с возрастом культивируемого материала и наоборот [1, 5].

Учитывая выше приведенное, целью данной работы было исследование возможности зиготического развития в культуре изолированных зерновок кукурузы in vitro и выяснение оптимальных условий для этого, а именно установление влияния генотипа и возраста на развитие составных элементов зерновки, концентрации углеводов и фитогормонов.

Материал и методы исследований

Материалом исследования служили инбредные линии кукурузы ДК366, простые гибриды кукурузы А22хДК307, ДК2/477-322хА22, ДК675хYuR75 и популяция ДК377. Для эксплантации на питательной среде использовали изолированные зерновки в возрасте 1-3-х и 5-7-х суток после опыления. Початки без оберток поверхностно стерилизовались в 70° этиловом спирте в течение 1-2-х секунд и троекратно промывали в стерильной дистиллированной воде.

Основной индуктивной средой в культуре зерновок была модифицированная питательная среда NBM по R. Mol (1993), которая вмещала макросоли N6, микросоли B5, 0,1 мг / л тиамина гидрохлорида, 0,5 мг / л пиридоксина гидрохлорида, 0,5 мг / л никотиновой кислоты, 7 г / л агара, 90; 120; 150 и 200 г / л сахарозы и 1, 2 мг / л 6-бензиламинопурина (БАП). Изолированные зерновки культивировали в чашках Петри, в положении – зародышем к среде. Культивирование проводили при температуре 26^оС в темноте. Развитие зерновок и зародышей in vitro оценивали по таким показателям как длина зерновки, внешнее и внутреннее состояние зерновки, наличие развитого эндосперма и зародыша, правильность сформированных зародышей, присутствие крахмала в эндосперме. Для обнаружения крахмала использовали реактив Люголя. Зародыши и зародышевые мешки проращивали на средах: Р5 и Р6, содержащих макро-и микросоли MS в половинной концентрации, 0,1 мг / л тиамина гидрохлорида, 0,5 мг / л пиридоксина гидрохлорида, 0,5 мг / л никотиновой кислоты, 15 г / л сахарозы, 50 мг / л мезо-инозита, 25 мг / л витамина С, 6 г / л агара, среда Р6 дополнительно содержало 2,5 г / л активированного угля.

Влияние генотипов на развитие зерновок кукурузы и их составляющих от стадии зиготы / проэмбрио изучали при культивировании изолированных зерновок генотипов ДК675хYuR75 и ДК377 в возрасте 2-х суток после опыления на среде NBM с 150 г / л сахарозы и 1 мг / л БАП. От глобулярной стадии зародыша, изучали изолированные зерновки генотипов ДК366, А22хДК307, ДК2/477-322хА22 в возрасте 5-7-и суток после опыления при культивировании на среде NBM с 90 г / л сахарозы и 1 мг / л БАП. Влияние возраста культивируемых объектов, концентраций сахарозы и 6-бензиламинопурина изучали при культивировании изолированных зерновок кукурузы гибрида ДК675хYuR75. Концентрацию сахарозы исследовали на среде NBM с 1 мг / л БАП для зерновок в возрасте 2-х суток после опыления, концентрацию 6-бензиламинопурина – NBM с 150 г / л сахарозы, для зерновок в возрасте 3-х суток после опыления. Культивирование для установления влияния возраста зерновок проводили на среде NBM с 150 г / л сахарозы и 1 мг / л БАП, для зерновок в возрасте 1-3-х суток после опыления.

Результаты и их обсуждение

На момент эксплантации длина зерновки кукурузы генотипов ДК675хYuR75, ДК377 в возрасте 1-3-х суток после опыления и генотипов А22хДК307, ДК2/477-322хА22, ДК366 в возрасте 5-7-и суток после опыления составляла примерно 2-3 мм и 4, 5-5 мм соответственно. Исследуемые зерновки относятся к незрелым. На 1-3-и сутки после опыления зерновка содержала зародышевый мешок (рис. 1а, б), длиной примерно 0,1 мм, зиготу или проэмбрио и несколько ядер эндосперма. На 5-7 сутки после опыления зерновка вмещала зародышевый мешок (рис. 1в, г), длиной примерно 1,2 мм, и зародыш — 0,1 мм. Зародыш находился на глобулярной стадии. Эндосперм в это время находится в процессе клеткообразования, крахмал в эндосперме отсутствует.

При культивировании изолированных зерновок наблюдалось увеличение их длины, но достоверной разницы между разными генотипами не выявлено (табл. 1, 2). Это справедливо для культивирования зерновок и от зиготы / проэмбрио, и от стадии глобулярного зародыша. При культивировании зерновок от стадии зиготы / проэмбрио, их длина на 50-е сутки увеличилась на 53,6% для гибрида ДК675хYuR75 и на 54,8% для популяции ДК377 по сравнению с длиной зерновки на момент эксплантации (см. табл. 1). Зерновки от глобулярной стадии зародыша выросли на 17% для линии ДК366, на 18% для гибрида А22хДК307 и на 22,4% для гибрида ДК2/477-322хА22 по сравнению с длиной зерновки на момент эксплантации (см. табл. 1). Установленая закономерность соответствует динамике развития in vivo, но в меньшей степени, так как зерновки в естественных условиях вырастают примерно до 8 мм. Длина зерновок исследуемых генотипов на 27-е сутки после опыления составила примерно 8,35 мм.

При культивировании менялось внутреннее состояние зерновок. Зерновки, содержавшие сформированные зачатки (с точками роста стебля и корня и сформированным щитком) и крахмал в эндосперме, были из белой, выполненный, мясистой, плотной или белой высохшей внутренностью (рис. 2а). Зерновки, имевшие хорошо развитые, крепкие покровы и жидкостное или желеобразное наполнение не накапливали крахмал в эндосперме и не содержали развитого зародыша (рис. 2б). Было установлено, что внутреннее состояние зерновки может служить маркерным признаком созревания зародышей и накопления крахмала в эндосперма при культивировании изолированных зерновок.

Исследование влияния генотипа на развитие эндосперма и накопления в нем крахмала выявило устойчивую зависимость от генотипа. Незрелые зерновки в возрасте 1-3-х суток после опыления содержали в зародышевом мешке лишь несколько ядер эндосперма. При следующем культивировании наблюдалось развитие эндосперма (2%), одновременно накапливался крахмал, у одного из двух исследованных генотипов ДК675хYuR75 (см. табл. 1). Незрелые зерновки в возрасте 5-7-х суток после опыления содержали эндосперм, что заканчивал процесс клеткообразования. У инбредной линии ДК366 накопление крахмала после культивирования шло интенсивнее (14,1%) по сравнению с гибридами А22хДК307 и ДК2/477-322хА22, в которых лишь единичные зерновки накапливали крахмал при культивировании (см. табл. 2). Установлено, что созревание зародышей в культуре изолированных зерновок кукурузы также зависит от генотипа. Это справедливо для созревания зародышей от зиготы / проэмбрио и от глобулярной стадии (см. табл. 1, 2). У раннеспелой линии ДК366 было получено 11,4% сформированных зародышей, 70,6% из которых правильного строения (включая зародыш с увеличенными точками роста и зародыш, проросший в зерновке), давшие растения при последующей регенерации (рис. 3а- в) (см. табл. 2). Другие зародыши были сформированы, но не правильного строения (рис. 3г). Оценка жизнеспособности обнаружила, что 64,3% зародышей инбредной линии, из всех созревших, были жизнеспособными, то есть способными дать зеленые побеги, с длиной побегов 1,5 — 13,5 мм и длиной корневой системы 0,2 — 10,5 мм ( рис. 3г, д). У гибридов А22хДК307 и ДК2/477-322хА22 нормальные зародыши были получены, но они не проявили себя как жизнеспособные. Зародыши, находящиеся на глобулярной и переходной стадии при подсчетах не учитывались. Длина зародыша после культивирования составила 1,75 — 2,05 мм для инбредной линии ДК366.

Во время культивирования изолированных зерновок в возрасте 1-3-х суток после опыления происходило созревание зародышей от стадии зиготы / проэмбрио (см. рис. 1а, б) до полностью зрелого сложившегося положения (рис. 4а, б), проросшие в 2% зерновок гибрида ДК675хYuR75 (см. табл. 1). Проросток был направлен к питательной среде (рис. 4в), извне зерновки наблюдалась дырка (рис. 4г).

В ходе исследования возраста культивируемых незрелых изолированных зерновок было замечено тенденцию, зерновки всех возрастов нуждаются в различных условиях культивирования. Установлено, что исследованные условия культивирования (среда NBM с 150 г / л сахарозы и 1 мг / л БАП) однозначно не подходят для культивирования зерновок в возрасте 1-х суток после опыления, так как они все полностью лопнули (рис. 5), не содержали развитого эндосперма и зародыша (табл. 3). Почти половина зерновок 3-х суток также лопнули, а зерновки 2-х суток лопнули лишь в 9% (см. табл. 3). Примерно четверть исследованных зерновок каждого возраста оказалась пустыми и полностью высохшими после культивирования (см. табл. 3). Достоверной разницы между длиной зерновки 2-й и 3-х суток после культивирования не выявлено (см. табл. 3). Зерновки 2-х и 3-х суток после опыления содержали примерно одинаковое количество развитого эндосперма, что при этом накопил крахмал (см. табл. 3). Однако, зерновки 2-х суток после опыления одновременно содержали и развитые зародыши, проросшие в зерновках (см. табл. 3) (см. рис. 4в), и их эндосперм был несколько большего размера — 3,5 мм, в отличие от 2 мм эндосперма, который содержали зерновки 3-х суток после культивирования.

Таким образом, было установлено, что возраст и генотип, изучаемых изолированных незрелых зерновок кукурузы, оказывает существенное влияние при культивировании, с целью разложения эндосперма и зародышей от стадии зиготы / проэмбрио. Это может быть связано с различным уровнем эндогенных гормонов и генетическим потенциалом вообще.

Было проведено исследование по воздействию разной концентрации 6-бензиламинопурина на культуру незрелых зерновок in vitro. Развитие зародыша не наблюдалось ни в каком из случаев. В обоих случаях наблюдалось развитие эндосперма — 2,2% зерновок содержали эндосперм размером 2 мм, в котором накопился при этом крахмал. Но относительно лучших результатов удалось добиться с концентрацией 6-бензиламинопурина в 1 мг / л, что обеспечило вдвое меньшее количество пустых, засохших зерновок (табл. 4). Таким образом, установлено, что концентрация 6-бензиламинопурина в размере 1 мг / л или 2 мг / л не существенно влияет на формирование эндосперма и доразвитие зародышей от стадии зиготы / проэмбрио.

В ходе исследования влияния концентрации сахарозы относительно лучших результатов удалось добиться со средней концентрацией, так как созревание зародышей (в 1,1% зерновок) и развитие эндосперма (в 2,1% зерновок) произошло на среде с 150 г / л сахарозы, развития эндосперма наблюдалось также на среде с 120 г / л сахарозы, но в меньшей степени (табл. 5). На среде с 200 г / л сахарозы не наблюдалось развития ни зародыша ни эндосперма. Количество пустых, высохших с середины зерновок примерно одинаково для трех исследованных концентраций (см. табл. 5). Количество лопнувших зерновок и их длина уменьшалась с ростом концентрации (см. табл. 5). На среде с 200 г / л сахарозы покровы были слишком толстые, по сравнению с другими вариантами концентраций сахарозы. Таким образом, выявлена тенденция, что концентрация сахарозы влияет на формирование эндосперма и доразвития зародышей от стадии зиготы / проэмбрио.

С точки зрения на затрудненность изоляции и работы с элементами семязачатка кукурузы альтернативой может быть проведение генетических манипуляций в середине него, без вредной изоляции его составляющих. Следующим этапом проводить культивирование целых зерновок на питательной среде. Это позволит максимально приблизиться к условиям in vivo в культуре in vitro, так как все процессы (формирование и созревание зародыша и эндосперма) будут происходить глубоко погруженными в материнские ткани, как и на растении. В данной работе было максимально получено 11,4% зерновок с созреванием зародышей от глобулярной стадии до зрелого сформированного строения и 2% — от зиготы / проэмбрио. Ранее было продемонстрировано, что в зерновке примерно на 8-е сутки в условиях in vivo концентрация цитокининов достигает максимума (этот возраст соответствует поздней переходной стадии развития зародыша), а позже начинает уменьшаться. Концентрация ауксинов в это время возрастает и начинается дифференциация органов зародыша [1]. Эти сведения свидетельствуют о необходимости дальнейшего исследования роли фитогормонов и, в частности, ауксинов в формировании органов зиготического зародыша кукурузы. Существует необходимость создания общей технологии зиготического развития зародыша по стадиям. Это предполагает индивидуальное определение концентрации углеводов, фитогормонов и условий культивирования вообще для зиготы / проэмбрио, глобулярной, ранней и поздней переходной стадий.

Выводы

Таким образом, полученные данные свидетельствуют о возможности доращивания и созревания зародышей в культуре изолированных зерновок кукурузы и получения жизнеспособных зародышей, которые дают крепкие, хорошо развитые зеленые проростки. Установлен факт накопления крахмала в эндосперме при культивировании на искусственной питательной среде. Установлено, что внутреннее состояние зерновки может служить маркерным признаком созревания зародышей и накопления крахмала в эндосперме независимо от генотипа. Установлено влияние генотипа, возраста культивируемых незрелых зерновок и концентрации сахарозы на развитие эндосперма, накопление в нем крахмала и доращивания зародышей от зиготы / проэмбрио и глобулярной стадии. Не выявлено четких закономерностей в применении 1 мг / л и 2 мг / л 6-бензиламинопурина для культивирования незрелых зерновок кукурузы от зиготы / проэмбрио и глобулярной стадии.

Библиографические источники

A novel technique for the partial isolation of the maize embryo sacs and subsequent regeneration of plants / J. D. Laurie, G. Zhang, I. E. McGann et al. // In Vitro Cell. Dev. Biol. – Plant. – 1999. – Vol. 35. – P. 320–325.
Cobb B.G., HannahL.C. Sugar Utilization by Developing Wild Type and Shrunken-2 Maize Kernels // Plant Physiol. – 1986. – Vol. 80. – P. 609 – 611.
Dumas C., Rogowsky P. Fertilization and early seed formation // Comptes Rendus Biologies. – 2008. – Vol. 331. – N 10. – P. 715 – 725.
Hauptli H., Williams S. Maize in vitro pollination with single pollen grains // Plant Science. – 1988. – Vol. 58. – P. 231 – 237.
He Y. Regeneration of fertile plants from isolated tobacco zygotes by in vitro culture / Y. He, M. Sun, H. Yang // Chinese Science Bulletin. – 2004. – V. 49 № 8. – P. 810–814.
Kranz E., Scholten S. In vitro fertilization: analysis of early post-fertilization development using cytological and molecular techniques // Sex Plant Reprod. – 2008. – V. 21. – P. 67–77.
Kumlehn J.Differentiation of isolated wheat zygotes into embryos and normal plants / J. Kumlehn, H. Lörz, E. Kranz // Planta. – 1998. – V. 205. – P. 327–333.
Mol R.Embryogenesis and plant regeneration from maize zygotes by in vitro culture of fertilized embryo sacs/ R.Mol, E.Matthys-Rochon,C.Dumas // Plant Cell Reports. – 1995. – Vol. 14. – P. 743 – 774.
Nagata T., Lorz H., Widholm M. Molecular genetic approaches to maize improvement. – Springer-Verlag.: Berlin Heidelberg. – 2009. – 365 p.
Positional cues for the starch / lipid balance in maize kernels and resource partitioning to the embryo / H.Rolletschek, K.Koch, U.Wobus et al. // The Plant Journal. – 2005. – Vol. 42. – P. 69 – 83.
Regeneration of fertile plants from isolated zygotes of rice (Oryza sativa) / J. Zhang, W. H. Dong, A. Galli et al. // Plant Cell Reports. – 1999. – V. 19. – P. 128–132.
Singletary G.W., Below F.E. Nitrogen-induced changes in the growth and metabolism of developing maize kernels grown in vitro // Plant Physiol. – 1990. – Vol. 92. – P. 160 – 167.
The effectsof modifying sucrose concentration on the development of maize kernels grown in vitro/ B. G. Cobb, D. J. Hole, J. D. Smith et al.//Annals of Botany. 1988. – V. 62. – P. 265-270.
Uchiumi T.Establishment of an invitro fertilization system in rice (Oryza sativa L.)/ T.Uchiumi, I.Uemura, T.Okamoto // Planta.– 2007. – V. 226. – P. 581–589.
Zea mays embryo sacs in culture. Plant regeneration from 1 day after pollination embryos / M. K. Campenot, G. Zhang, A. J. Culteret al. // Amer. J. Bot. – 1992. – V. 79. – P. 1368–1373.
Zhao J.Isolation and in vitro culture of zygotes and central cells of Oryza sativa L./ J.Zhao, C. Zhou, H. Y.Yang //Plant Cell Reports. –2000. – V.19. – P.321–326.
Zygote implantation to cultured ovules leads to direct embryogenesisand plant regeneration of wheat / J. Kumlehn, R. Brettschneider, H. Lorz et al. // Plant J. – 1997. – V. 12. – P. 1473–1479.

Источник: Ляпустіна О.В. Культура ізольованих зернівок як біотехнологічна система дорощування зиготичних зародків кукурудзи in vitro // Вісник Дніпропетровського університету. Біологія. Медицина. – 2010. – Вип.18,Т.2. – С.49-57.

Автор фото в статье: Ляпустина Е.В.