Вы здесь

Культура зерновок как биотехнология культуры зародышей кукурузы in vitro

Голосов еще нет
Культура зерновок

Культура изолированных зерновок как биотехнологическая система доращивания зиготических зародышей кукурузы in vitro

Установлена возможность получения жизнеспособных зародышей полной зрелости в культуре изолированных зерновок кукурузы на искусственной питательной среде в условиях in vitro от зиготы / проэмбрио и глобулярной стадии. Установлен факт накопления крахмала в эндосперме при культивировании на искусственной питательной среде. Внутреннее состояние зерновки может служить маркерным признаком созревания зародышей и накопления крахмала в эндосперме независимо от генотипа. Генотип, возраст культивируемых зерновок и концентрация сахарозы влияют на развитие эндосперма, накопление в нем крахмала и доращивание зародышей от зиготы / проэмбрио и глобулярной стадии.

Введение

Развитие в культуре in vitro элементов мужской и женской генеративной сферы от ранних этапов до зрелости, предусматривающие культивирование на искусственных питательных средах, является многообещающим направлением для моделирования и объяснения процессов регенерации растений [9]. Широко распространенными являются исследования in vitro культур зигот, зародышевых мешков и зародышей [3]. Эти элементы представляют большой интерес для широкого круга генетических манипуляций, а именно: изолирование гамет, их слияние, доращивание полученных зигот и изолированных зародышевых мешков, содержащих зиготу или проэмбрио, доращивание изолированных незрелых зародышей. Процедура изоляции элементов зерновки трудозатратная, долговременная и требует применения ферментов, дающих ограниченные перспективы для использования изучаемых объектов, из-за их сомнительной жизнеспособности [1, 5, 16]. Условия во время культивирования должны максимально приближаться к условиям на растении. Поэтому проводят культивирование с частью ткани материнского или отцовского организма для длительного роста [6]. Условия развития эндосперма и зародышей не совпадают, каждый из них требует особых условий культивирования [4, 8]. У кукурузы положительных результатов получено при культивировании оплодотворенных зародышевых мешков с тканями нуцеллуса, покровами семян [1, 15]. Для табака, пшеницы и риса использовали яйцеклетки при культивировании изолированных зигот [5, 14, 17].

Изолированные зерновки являются удачным объектом для исследования факторов, существенно влияющих на регенерационные процессы у растений. Выяснению подлежат: влияние генотипа и возраста культивируемых объектов, продолжительность культивирования, установления оптимальной концентрации углеводов и фитогормонов, необходимость применения субкультуры и прочее. Культивирование целых зерновок позволит более детально изучить физиологию развития эндосперма, зародыша и зерновки в целом. Путями исследования могут быть эмбриологические и метаболические направления, то есть как с точки зрения формирования и развития эндосперма, зародыша, так и с точки зрения углеводородного и азотного обмена веществ. Культура зерновок кукурузы, изолированных от початка в условиях in vitro до сих пор не изучалась. В культуре in vitro зерновки кукурузы с сегментами початка были использованы в исследованиях по углеводородному и белковому метаболизму [2, 12, 13]. В условиях in vivo в изолированных зерновках было исследовано крахмало-липидный баланс [10].

Выбор питательной среды достаточно важен, он указывает на способность и компетентность системы in vitro. Среда влияет на развитие эксплантатов, не только обеспечивая условия для развития, но и влияет на возможность ускорения развития исследуемых объектов. Базовой и универсальной средой для многих видов растений, разного возраста, разного типа эксплантатов является среда Мурасиге-Скуга. Но универсальное не значит лучше. Остается проблема оптимизации питательной среды для каждого вида растений и для каждого случая отдельно.

Во время культивирования изолированных объектов различных генотипов могут отсутствовать различия относительно времени первого деления зиготы, и на первый взгляд выбранные генотипы имеют равные вероятности развития. Но главное отличие заключается в потенциале зиготы при дальнейшем развитии и образовании многоклеточных структур. Генотип влияет на возможность развития зиготы по пути прямого эмбриогенеза, образования каллуса или нескольких зародышей из одной зиготы. Есть свидетельства о влиянии генотипа на культуру зигот табака [5], риса [11], пшеницы [7]. Несмотря на наличие свидетельств, о важности влияния генотипа в процессе культивирования растений, этому вопросу, у кукурузы, было уделено недостаточно внимания. Возраст культивируемых объектов также имеет существенное влияние на дальнейшее развитие. Это может быть связано с уровнями эндогенных гормонов, состав которых в разном возрасте разный. В этой связи существует необходимость оптимизации состава питательной среды в соответствии с возрастом культивируемого материала и наоборот [1, 5].

Учитывая выше приведенное, целью данной работы было исследование возможности зиготического развития в культуре изолированных зерновок кукурузы in vitro и выяснение оптимальных условий для этого, а именно установление влияния генотипа и возраста на развитие составных элементов зерновки, концентрации углеводов и фитогормонов.

Материал и методы исследований

Материалом исследования служили инбредные линии кукурузы ДК366, простые гибриды кукурузы А22хДК307, ДК2/477-322хА22, ДК675хYuR75 и популяция ДК377. Для эксплантации на питательной среде использовали изолированные зерновки в возрасте 1-3-х и 5-7-х суток после опыления. Початки без оберток поверхностно стерилизовались в 70° этиловом спирте в течение 1-2-х секунд и троекратно промывали в стерильной дистиллированной воде.

Основной индуктивной средой в культуре зерновок была модифицированная питательная среда NBM по R. Mol (1993), которая вмещала макросоли N6, микросоли B5, 0,1 мг / л тиамина гидрохлорида, 0,5 мг / л пиридоксина гидрохлорида, 0,5 мг / л никотиновой кислоты, 7 г / л агара, 90; 120; 150 и 200 г / л сахарозы и 1, 2 мг / л 6-бензиламинопурина (БАП). Изолированные зерновки культивировали в чашках Петри, в положении – зародышем к среде. Культивирование проводили при температуре 26оС в темноте. Развитие зерновок и зародышей in vitro оценивали по таким показателям как длина зерновки, внешнее и внутреннее состояние зерновки, наличие развитого эндосперма и зародыша, правильность сформированных зародышей, присутствие крахмала в эндосперме. Для обнаружения крахмала использовали реактив Люголя. Зародыши и зародышевые мешки проращивали на средах: Р5 и Р6, содержащих макро-и микросоли MS в половинной концентрации, 0,1 мг / л тиамина гидрохлорида, 0,5 мг / л пиридоксина гидрохлорида, 0,5 мг / л никотиновой кислоты, 15 г / л сахарозы, 50 мг / л мезо-инозита, 25 мг / л витамина С, 6 г / л агара, среда Р6 дополнительно содержало 2,5 г / л активированного угля.

Влияние генотипов на развитие зерновок кукурузы и их составляющих от стадии зиготы / проэмбрио изучали при культивировании изолированных зерновок генотипов ДК675хYuR75 и ДК377 в возрасте 2-х суток после опыления на среде NBM с 150 г / л сахарозы и 1 мг / л БАП. От глобулярной стадии зародыша, изучали изолированные зерновки генотипов ДК366, А22хДК307, ДК2/477-322хА22 в возрасте 5-7-и суток после опыления при культивировании на среде NBM с 90 г / л сахарозы и 1 мг / л БАП. Влияние возраста культивируемых объектов, концентраций сахарозы и 6-бензиламинопурина изучали при культивировании изолированных зерновок кукурузы гибрида ДК675хYuR75. Концентрацию сахарозы исследовали на среде NBM с 1 мг / л БАП для зерновок в возрасте 2-х суток после опыления, концентрацию 6-бензиламинопурина – NBM с 150 г / л сахарозы, для зерновок в возрасте 3-х суток после опыления. Культивирование для установления влияния возраста зерновок проводили на среде NBM с 150 г / л сахарозы и 1 мг / л БАП, для зерновок в возрасте 1-3-х суток после опыления.

Результаты и их обсуждение

На момент эксплантации длина зерновки кукурузы генотипов ДК675хYuR75, ДК377 в возрасте 1-3-х суток после опыления и генотипов А22хДК307, ДК2/477-322хА22, ДК366 в возрасте 5-7-и суток после опыления составляла примерно 2-3 мм и 4, 5-5 мм соответственно. Исследуемые зерновки относятся к незрелым. На 1-3-и сутки после опыления зерновка содержала зародышевый мешок (рис. 1а, б), длиной примерно 0,1 мм, зиготу или проэмбрио и несколько ядер эндосперма. На 5-7 сутки после опыления зерновка вмещала зародышевый мешок (рис. 1в, г), длиной примерно 1,2 мм, и зародыш - 0,1 мм. Зародыш находился на глобулярной стадии. Эндосперм в это время находится в процессе клеткообразования, крахмал в эндосперме отсутствует.

При культивировании изолированных зерновок наблюдалось увеличение их длины, но достоверной разницы между разными генотипами не выявлено (табл. 1, 2). Это справедливо для культивирования зерновок и от зиготы / проэмбрио, и от стадии глобулярного зародыша. При культивировании зерновок от стадии зиготы / проэмбрио, их длина на 50-е сутки увеличилась на 53,6% для гибрида ДК675хYuR75 и на 54,8% для популяции ДК377 по сравнению с длиной зерновки на момент эксплантации (см. табл. 1). Зерновки от глобулярной стадии зародыша выросли на 17% для линии ДК366, на 18% для гибрида А22хДК307 и на 22,4% для гибрида ДК2/477-322хА22 по сравнению с длиной зерновки на момент эксплантации (см. табл. 1). Установленая закономерность соответствует динамике развития in vivo, но в меньшей степени, так как зерновки в естественных условиях вырастают примерно до 8 мм. Длина зерновок исследуемых генотипов на 27-е сутки после опыления составила примерно 8,35 мм.

При культивировании менялось внутреннее состояние зерновок. Зерновки, содержавшие сформированные зачатки (с точками роста стебля и корня и сформированным щитком) и крахмал в эндосперме, были из белой, выполненный, мясистой, плотной или белой высохшей внутренностью (рис. 2а). Зерновки, имевшие хорошо развитые, крепкие покровы и жидкостное или желеобразное наполнение не накапливали крахмал в эндосперме и не содержали развитого зародыша (рис. 2б). Было установлено, что внутреннее состояние зерновки может служить маркерным признаком созревания зародышей и накопления крахмала в эндосперма при культивировании изолированных зерновок.

Исследование влияния генотипа на развитие эндосперма и накопления в нем крахмала выявило устойчивую зависимость от генотипа. Незрелые зерновки в возрасте 1-3-х суток после опыления содержали в зародышевом мешке лишь несколько ядер эндосперма. При следующем культивировании наблюдалось развитие эндосперма (2%), одновременно накапливался крахмал, у одного из двух исследованных генотипов ДК675хYuR75 (см. табл. 1). Незрелые зерновки в возрасте 5-7-х суток после опыления содержали эндосперм, что заканчивал процесс клеткообразования. У инбредной линии ДК366 накопление крахмала после культивирования шло интенсивнее (14,1%) по сравнению с гибридами А22хДК307 и ДК2/477-322хА22, в которых лишь единичные зерновки накапливали крахмал при культивировании (см. табл. 2). Установлено, что созревание зародышей в культуре изолированных зерновок кукурузы также зависит от генотипа. Это справедливо для созревания зародышей от зиготы / проэмбрио и от глобулярной стадии (см. табл. 1, 2). У раннеспелой линии ДК366 было получено 11,4% сформированных зародышей, 70,6% из которых правильного строения (включая зародыш с увеличенными точками роста и зародыш, проросший в зерновке), давшие растения при последующей регенерации (рис. 3а- в) (см. табл. 2). Другие зародыши были сформированы, но не правильного строения (рис. 3г). Оценка жизнеспособности обнаружила, что 64,3% зародышей инбредной линии, из всех созревших, были жизнеспособными, то есть способными дать зеленые побеги, с длиной побегов 1,5 - 13,5 мм и длиной корневой системы 0,2 - 10,5 мм ( рис. 3г, д). У гибридов А22хДК307 и ДК2/477-322хА22 нормальные зародыши были получены, но они не проявили себя как жизнеспособные. Зародыши, находящиеся на глобулярной и переходной стадии при подсчетах не учитывались. Длина зародыша после культивирования составила 1,75 - 2,05 мм для инбредной линии ДК366.

Во время культивирования изолированных зерновок в возрасте 1-3-х суток после опыления происходило созревание зародышей от стадии зиготы / проэмбрио (см. рис. 1а, б) до полностью зрелого сложившегося положения (рис. 4а, б), проросшие в 2% зерновок гибрида ДК675хYuR75 (см. табл. 1). Проросток был направлен к питательной среде (рис. 4в), извне зерновки наблюдалась дырка (рис. 4г).

В ходе исследования возраста культивируемых незрелых изолированных зерновок было замечено тенденцию, зерновки всех возрастов нуждаются в различных условиях культивирования. Установлено, что исследованные условия культивирования (среда NBM с 150 г / л сахарозы и 1 мг / л БАП) однозначно не подходят для культивирования зерновок в возрасте 1-х суток после опыления, так как они все полностью лопнули (рис. 5), не содержали развитого эндосперма и зародыша (табл. 3). Почти половина зерновок 3-х суток также лопнули, а зерновки 2-х суток лопнули лишь в 9% (см. табл. 3). Примерно четверть исследованных зерновок каждого возраста оказалась пустыми и полностью высохшими после культивирования (см. табл. 3). Достоверной разницы между длиной зерновки 2-й и 3-х суток после культивирования не выявлено (см. табл. 3). Зерновки 2-х и 3-х суток после опыления содержали примерно одинаковое количество развитого эндосперма, что при этом накопил крахмал (см. табл. 3). Однако, зерновки 2-х суток после опыления одновременно содержали и развитые зародыши, проросшие в зерновках (см. табл. 3) (см. рис. 4в), и их эндосперм был несколько большего размера - 3,5 мм, в отличие от 2 мм эндосперма, который содержали зерновки 3-х суток после культивирования.

Таким образом, было установлено, что возраст и генотип, изучаемых изолированных незрелых зерновок кукурузы, оказывает существенное влияние при культивировании, с целью разложения эндосперма и зародышей от стадии зиготы / проэмбрио. Это может быть связано с различным уровнем эндогенных гормонов и генетическим потенциалом вообще.

Было проведено исследование по воздействию разной концентрации 6-бензиламинопурина на культуру незрелых зерновок in vitro. Развитие зародыша не наблюдалось ни в каком из случаев. В обоих случаях наблюдалось развитие эндосперма - 2,2% зерновок содержали эндосперм размером 2 мм, в котором накопился при этом крахмал. Но относительно лучших результатов удалось добиться с концентрацией 6-бензиламинопурина в 1 мг / л, что обеспечило вдвое меньшее количество пустых, засохших зерновок (табл. 4). Таким образом, установлено, что концентрация 6-бензиламинопурина в размере 1 мг / л или 2 мг / л не существенно влияет на формирование эндосперма и доразвитие зародышей от стадии зиготы / проэмбрио.

В ходе исследования влияния концентрации сахарозы относительно лучших результатов удалось добиться со средней концентрацией, так как созревание зародышей (в 1,1% зерновок) и развитие эндосперма (в 2,1% зерновок) произошло на среде с 150 г / л сахарозы, развития эндосперма наблюдалось также на среде с 120 г / л сахарозы, но в меньшей степени (табл. 5). На среде с 200 г / л сахарозы не наблюдалось развития ни зародыша ни эндосперма. Количество пустых, высохших с середины зерновок примерно одинаково для трех исследованных концентраций (см. табл. 5). Количество лопнувших зерновок и их длина уменьшалась с ростом концентрации (см. табл. 5). На среде с 200 г / л сахарозы покровы были слишком толстые, по сравнению с другими вариантами концентраций сахарозы. Таким образом, выявлена тенденция, что концентрация сахарозы влияет на формирование эндосперма и доразвития зародышей от стадии зиготы / проэмбрио.

С точки зрения на затрудненность изоляции и работы с элементами семязачатка кукурузы альтернативой может быть проведение генетических манипуляций в середине него, без вредной изоляции его составляющих. Следующим этапом проводить культивирование целых зерновок на питательной среде. Это позволит максимально приблизиться к условиям in vivo в культуре in vitro, так как все процессы (формирование и созревание зародыша и эндосперма) будут происходить глубоко погруженными в материнские ткани, как и на растении. В данной работе было максимально получено 11,4% зерновок с созреванием зародышей от глобулярной стадии до зрелого сформированного строения и 2% - от зиготы / проэмбрио. Ранее было продемонстрировано, что в зерновке примерно на 8-е сутки в условиях in vivo концентрация цитокининов достигает максимума (этот возраст соответствует поздней переходной стадии развития зародыша), а позже начинает уменьшаться. Концентрация ауксинов в это время возрастает и начинается дифференциация органов зародыша [1]. Эти сведения свидетельствуют о необходимости дальнейшего исследования роли фитогормонов и, в частности, ауксинов в формировании органов зиготического зародыша кукурузы. Существует необходимость создания общей технологии зиготического развития зародыша по стадиям. Это предполагает индивидуальное определение концентрации углеводов, фитогормонов и условий культивирования вообще для зиготы / проэмбрио, глобулярной, ранней и поздней переходной стадий.

Выводы

Таким образом, полученные данные свидетельствуют о возможности доращивания и созревания зародышей в культуре изолированных зерновок кукурузы и получения жизнеспособных зародышей, которые дают крепкие, хорошо развитые зеленые проростки. Установлен факт накопления крахмала в эндосперме при культивировании на искусственной питательной среде. Установлено, что внутреннее состояние зерновки может служить маркерным признаком созревания зародышей и накопления крахмала в эндосперме независимо от генотипа. Установлено влияние генотипа, возраста культивируемых незрелых зерновок и концентрации сахарозы на развитие эндосперма, накопление в нем крахмала и доращивания зародышей от зиготы / проэмбрио и глобулярной стадии. Не выявлено четких закономерностей в применении 1 мг / л и 2 мг / л 6-бензиламинопурина для культивирования незрелых зерновок кукурузы от зиготы / проэмбрио и глобулярной стадии.

Библиографические источники

  1. A novel technique for the partial isolation of the maize embryo sacs and subsequent regeneration of plants / J. D. Laurie, G. Zhang, I. E. McGann et al. // In Vitro Cell. Dev. Biol. – Plant. – 1999. – Vol. 35. – P. 320–325.
  2. Cobb B.G., HannahL.C. Sugar Utilization by Developing Wild Type and Shrunken-2 Maize Kernels // Plant Physiol. – 1986. – Vol. 80. – P. 609 – 611.
  3. Dumas C., Rogowsky P. Fertilization and early seed formation // Comptes Rendus Biologies. – 2008. – Vol. 331. – N 10. – P. 715 – 725.
  4. Hauptli H., Williams S. Maize in vitro pollination with single pollen grains // Plant Science. – 1988. – Vol. 58. – P. 231 – 237.
  5. He Y. Regeneration of fertile plants from isolated tobacco zygotes by in vitro culture / Y. He, M. Sun, H. Yang // Chinese Science Bulletin. – 2004. – V. 49 № 8. – P. 810–814.
  6. Kranz E., Scholten S. In vitro fertilization: analysis of early post-fertilization development using cytological and molecular techniques // Sex Plant Reprod. – 2008. – V. 21. – P. 67–77.
  7. Kumlehn J.Differentiation of isolated wheat zygotes into embryos and normal plants / J. Kumlehn, H. Lörz, E. Kranz // Planta. – 1998. – V. 205. – P. 327–333.
  8. Mol R.Embryogenesis and plant regeneration from maize zygotes by in vitro culture of fertilized embryo sacs/ R.Mol, E.Matthys-Rochon,C.Dumas // Plant Cell Reports. – 1995. – Vol. 14. – P. 743 – 774.
  9. Nagata T., Lorz H., Widholm M. Molecular genetic approaches to maize improvement. – Springer-Verlag.: Berlin Heidelberg. – 2009. – 365 p.
  10. Positional cues for the starch / lipid balance in maize kernels and resource partitioning to the embryo / H.Rolletschek, K.Koch, U.Wobus et al. // The Plant Journal. – 2005. – Vol. 42. – P. 69 – 83.
  11. Regeneration of  fertile plants from isolated zygotes of rice (Oryza sativa) / J. Zhang, W. H. Dong, A. Galli et al. // Plant Cell Reports. – 1999. – V. 19. – P. 128–132.
  12. Singletary G.W., Below F.E. Nitrogen-induced changes in the growth and metabolism of developing maize kernels grown in vitro // Plant Physiol. – 1990. – Vol. 92. – P. 160 – 167.
  13. The effectsof modifying sucrose concentration on the development of maize kernels grown in vitro/ B. G. Cobb, D. J. Hole, J. D. Smith et al.//Annals of Botany. 1988. – V. 62. – P. 265-270.
  14. Uchiumi T.Establishment of an invitro fertilization system in rice (Oryza sativa L.)/ T.Uchiumi, I.Uemura, T.Okamoto // Planta.– 2007. – V. 226. – P. 581–589.
  15. Zea mays embryo sacs in culture. Plant regeneration from 1 day after pollination embryos / M. K. Campenot, G. Zhang, A. J. Culteret al. // Amer. J. Bot. – 1992. – V. 79. – P. 1368–1373.
  16. Zhao J.Isolation and in vitro culture of zygotes and central cells of Oryza sativa L./ J.Zhao, C. Zhou, H. Y.Yang //Plant Cell Reports. –2000. – V.19. – P.321–326.
  17. Zygote implantation to cultured ovules leads to direct embryogenesisand plant regeneration of wheat / J. Kumlehn, R. Brettschneider, H. Lorz et al. // Plant J. – 1997. – V. 12. – P. 1473–1479.

Источник: Ляпустіна О.В. Культура ізольованих зернівок як біотехнологічна система дорощування зиготичних зародків кукурудзи in vitro // Вісник Дніпропетровського університету. Біологія. Медицина. – 2010. – Вип.18,Т.2. – С.49-57.

Автор фото в статье: Ляпустина Е.В.

Добавить комментарий