Развитие сельского хозяйства на Украине в условиях жёсткой конкуренции как на внешнем, так и на внутреннем рынках, невозможно без внедрения новых технологий, которые призваны способствовать снижению себестоимости производимой продукции, а так же ускорению производственного процесса наряду с улучшением качества производимой продукции. Получение коммерческих гибридов кукурузы, в настоящее время основано на получении путём многолетних инбредных скрещиваний так называемых «чистых» или гомозиготных линий, при последующем скрещивании которых получают высокогетерозисные гибриды первого поколения, предназначенные для коммерческого использования. Этот процесс требует в среднем 5-7 лет селекционной работы, является довольно дорогостоящим и трудоёмким. Внедрение в селекционную практику метода генетического маркирования Чейза, позволит сократить этот процесс до 2-3 лет и значительно снизить затраты на производствогибридов. Метод генетического маркирования пока ещё не нашёл широкого применения в селекции, тем не менее данные,имеющиеся по этому вопросу в литературе, а так же наши собственные исследования, позволяют надеяться на то, что дальнейшее изучение и разработка данного метода позволят уже в ближайшее время обеспечить его внедрение и успешное использование в селекционной работе, что должно способствовать созданию высококачественного семенного материала отечественного производства, не уступающего по своим товарным свойствам лучшим зарубежным образцам.
Суть метода генетического маркирования S.S.Chase
Метод генетического маркирования, предложенный S.S.Chase (1949, 1969) был разработан для выявления гаплоидов кукурузы. В основе метода лежит использование для скрещиваний линий с заранее известными генетическими различиями по одному или нескольким признакам. Материнская линия, от которой предполагается получить матроклинные гаплоиды, должна иметь рецессивные признаки, а отцовская – доминантные. При анализе полученного в результате скрещивания потомства, растения несущие доминантный признак выбраковываются как полученные в результате оплодотворения, растения же рецессивные по маркерному признаку, отбираются как условные гаплоиды. Как показывает практика, среди отобранных условных гаплоидов только часть оказывается истинными гаплоидами, остальные в силу некоторых причин оказываются диплоидными (Тырнов, 1976).
Первоначально, отбор по методу генетического маркирования производился в фазе проростков, и в качестве маркерных признаков использовалась антоциановая пигментация корней и стебля. Метод выявления гаплоидов по маркированным проросткам оказался слишком трудоемким, поскольку требовал выращивания и анализа нескольких десятков или даже сотен тысяч растений. Более приемлемым оказался наиболее широко применяемый в настоящее время метод предполагающий возможность генетического маркирования не проростков, а сухих зерновок.
Маркер, предложенный Nanda и Chase (1966) несёт в своём генотипе гены bplACRNj:cudupr pWr, обуславливающие сильную пигментацию алейрона и зародыша. Для получения матроклинных гаплоидов, эта линия используется в качестве опылителя, при этом предполагается, что материнские растения не несут генов окраски зародыша (Тырнов, 1976).
Метод генетического маркирования применим не только в отношении кукурузы, но и по отношению к другим культурам. Приведём лишь некоторые примеры. Так метод генетического маркирования с успехом был применён для выявления гаплоидов табака (Stokes, 1963), картофеля (Peloquin, Hougas, 1959), хлопчатника (Owings et al., 1964), капусты (Thompson, 1956) и др.
Маркеры
Естественным препятствием на пути внедрения метода гаплоидии в селекционный процесс, является низкая частота появления гаплоидных растений, в связи с чем, большое внимание было уделено совершенствованию маркеров, то есть созданию маркеров несущих в своем генотипе доминантные гены окраски АCRnj в гомозиготном состоянии совместно с высоким стимулирующим воздействием на материнские растения, что ведет к возникновению матроклинного гаплоидного потомства.
Как уже указывалось выше, на первых этапах исследований связанных с гаплоидией использовались различные модификации маркера РЕМ, вызывавшие матроклинную гаплоидию с небольшой частотой (0,08-1%) однако отвечавшие вместе с тем требованиям по окраске зерна и пыльцеобразовательной способности (Забирова, Шацкая, 1999). Маркер Stock 6 полученный Nuffer, Coe (1956) характеризовался сравнительно более высокой индуцирующей способностью и при его использовании в качестве опылителя стимулировал гаплоидию с частотой достигающей 3%. Маркер ЗМС (зародышевый маркер саратовский) был получен в Саратовском государственном университете В.С. Тырновым и А.Н. Завалишиной (1984) индуцировал гаплоидию с частотой 1-2%. Созданные в Краснодарском НИИ сельского хозяйства маркеры ЗМК-1 (зародышевый маркер краснодарский), ЗМК-2, ЗМК2-6 и другие, характеризуются значительно более высокой частотой индукции гаплоидии, которая в отдельных случаях достигает 13% (Забирова, Шацкая, 1999). Как отмечают авторы, благодаря отбору на гомозиготность по генам окраски ACRnj, а так же частично вследствие совершенствования навыков по отбору гаплоидных зерновок, количество истинных гаплоидов, среди первоначально отобранных, возросло от 20% на начальных этапах работы, до 70-80%, а на некоторых генотипах до 90-100%.
Методика получения и выделения исследуемого материала
После гибридизации исходной формы, с маркером на початке можно выделить четыре типа зерновок. Подавляющее большинство – это зерновки с пигментированным зародышем и алейроном, то есть – гибридные зерновки. Другая, сравнительно малочисленная группа – это зерновки с неокрашенным зародышем и алейроном, которые предположительно, возникают в результате загрязнения посторонней пыльцой во время гибридизации. Кроме того, встречается и третья группа зерновок – с окрашенным зародышем, и неокрашенным алейроном – эти зерновки результат гетерооплодотворения, то есть результат оплодотворения одного зародышевого мешка пыльцевыми зёрнами двух различных растений различающихся генами окраски (Забирова, Шацкая,1999). Последняя, четвёртая группа представлена зерновками с окрашенным алейроном и неокрашенным зародышем – это искомые, гаплоидные зерновки. Эндосперм таких зерновок – гибридный, а зародыш гаплоидный, развившийся из яйцеклетки без участия генетического материала отцовской формы. При осмотре маркированных початков, зерновки, относящиеся к первым трём группам, удаляются, а для дальнейшей работы отбираются зерновки четвёртой группы, которые предположительно являются гаплоидными (Забирова, Шацкая, 1999).
Зерновки, отобранные как условно гаплоидные, высаживают в почву, и после проращивания, на фазе третьего-пятого листа обрабатывают 0,125% раствором колхицина (Забирова, Шацкая 1999). Частота диплоидизации при использовании этого метода подсчитывается как отношение растений с озернёнными початками после самоопыления, к общему числу обработанных гаплоидов и составляет по данным Э.Р. Забировой и О.А. Шацкой (1999) от 25 до 60% в зависимости от генотипа исследуемых растений. Однако, как указывается в работе Б.В. Дзюбецкого, В.Ю. Черчеля, Т.Н. Сатаровой (2004) низкая фертильность пыльцы, а так же большой разрыв в цветении метёлок и початков могут сделать невозможным самоопыление и послужить причиной понижения эффективности диплоидизации, поэтому авторами предлагается при расчёте эффективности диплоидизации учитывать фертильность пыльцы.
Автор статьи: Струнин Д.Е.