Все цитоморфологические исследования проводились на давленых препаратах, приготовленных по стандартным методикам [7, 48, 129, 130]. Для проведения цитоморфологических исследований каллус фиксировали по Карнуа (в смеси этанол-ЛУК-хлороформ – 6:3:1 или этанол-ЛУК – 3:1) в течение 12-ти часов при комнатной температуре или 24-е часа при температуре 4-6 0С. Фиксированный материал промывали в 3-4-х порциях 70 %-го этилового спирта до исчезновения запаха уксусной кислоты и хранили в 70 %-ом растворе этанола.
Для окрашивания использовали 1 %-ный раствор ацетокармина (1-2 г кармина (Merck, Германия), растворяли при подогревании на водяной бане в колбе с обратным холодильником в течение 45-60-ти минут в смеси 45 мл ЛУК, 45 мл дистиллированной воды и 10 мл 96 % этанола. После остывания темно-красный раствор ацетокармина отфильтровывали и использовали для окрашивания препаратов); 0,2 % раствор метиленового голубого (200 мг красителя растворяли в 25 мл 96 % этанола, доводили дистиллированной водой до 100 мл) [148]. Для выявления запасного крахмала использовали раствор Люголя (250 мг I2, 750 мг KI в 50 мл воды), для выявления запасных липидов – насыщенный раствор судана-III в 70 % этаноле. В качестве красителей на общие белки использовали амидочерный-10Б.
Методика окрашивания:
- ацетокармином: материал помещали на предметное стекло с лункой в каплю красителя. Подогревали до температуры 70 0С над пламенем спиртовки в течение 3-5-ти мин, при необходимости прибавляя краситель по каплям. Остатки красителя удаляли фильтровальной бумагой, окрашенный материал для дифференцировки и мацерации помещали в 90 % уксусную кислоту, нагревая еще 5-10 мин. После чего переносили на предметное стекло, заключали в каплю глицерина или смеси хлоралгидрат-вода-глицерин (5:2:1), накрывали покровным стеклом и раздавливали постукиванием обратной стороны препарировальной иглы до равномерного распределения клеток.
- метиленовым голубым, раствором Люголя, суданом-III: материал помещали на предметное стекло в каплю красителя на 3-5 мин, после чего, удалив остатки красителя фильтровальной бумагой или смыванием дистиллированной водой, проводили раздавливание.
Исследование препаратов проводили на микроскопе МРI-5, с окуляром 10× и объективами 5×, 10×, 20×, 40× и 100×. Размеры клеток определяли при помощи шкалы окуляр-микрометра МОВ-1–15 и объект-микрометра ОМП (при увеличении 15×8).
Проведение микрофотосъемки осуществляли цифровой фотокамерой OlympusFE-190 (Olympus Imaging, США).
Метод тонкослойной хроматографии
Для химического анализа на содержание тритерпеновых гликозидов (ТГ) каллусы, находящиеся в стационарной фазе роста, извлекали из культуральных сосудов и высушивали при температуре 60 0С. Воздушно-сухую массу тщательно измельчали и экстрагировали 80 %-ным изопропиловым спиртом при температуре кипения изопропанола. Для выявления наличия ТГ использовали ТСХ-анализ, который проводили на пластинках «Silufol» («Kavalier», Чехословакия) [101, 180]. Для разделения ТГ на фракции использовали нейтральную систему растворителей хлороформ-метанол-вода (100:40:7). Детектирование пятен ТГ на хроматограммах осуществляли 10 %-ным спиртовым раствором фосфорновольфрамовой кислоты с добавлением 2 % пара-оксибензальдегида с последующим нагреванием хроматограмм при 100-105 0С. В качестве контроля использовали водно-спиртовые растворы экстрактов из листьев и корней C. vitalba.
При определении содержания ТГ в биомассе каллусов использовали показатель относительного содержания гликозидов (ОСГ), который рассчитывался (полуколичественно) по площади пятен фракций гликозидов после проявления хроматограмм. При этом за контроль (максимально возможное количество гликозидов в пробе) была принята концентрация ТГ в органах интактных растений.
Все полученные экспериментальные данные подвергались обработке с помощью методов статистического анализа [96, 133, 145].
В ходе выполнения исследований и при оформлении работы использовали следующее программное обеспечение: внутреннее приложение WindowsXP, пакет прикладных программ MicrosoftOffice, фотографии и рисунки обрабатывались при помощи пакета прикладных программ CorelDraw13.0.
Ссылки на литературу в тексте соответствуют источнику Индуцированный морфогенез in vitro и накопление тритерпеновых гликозидов в каллусных культурах ломоноса виноградолистного (Clematis vitalba L.)
Источник: Сидякин А.И., Индуцированный морфогенез in vitro и накопление тритерпеновых гликозидов в каллусных культурах ломоноса виноградолистного (Clematis vitalba L.): Дис. … канд. биол. наук. Симферополь. 2011. – 217 с.
Автор фото в статье: Ляпустина Е.В.
Материал любезно предоставил Сидякин Андрей Иванович – к.б.н., ас. каф. ботаники и физиологии растений и биотехнологий и м.н.с. Биотехнологического центра НИЧ Таврического национального университета им. В.И. Вернадского, научный консультант ООО КрымБио