Асептика, антисептика и дезинфекция – методы стерилизации в биотехнологии
Асептика — средства по предотвращению попадания микроорганизмов из окружающей среды в организм человека при лечебно-диагностических манипуляциях и в исследовательский материал и питательные среды в биотехнологических производствах. Предполагается стерилизация инструментов, материалов, рук персонала и соблюдение санитарно-гигиенических правил и приемов в работе (например, стерилизация инструментов, использование халатов, перчаток и т.д.).
Антисептика — средства по уничтожению микроорганизмов, которые способны вызвать заражение кожных и слизистых покровов. Для этого используются химические вещества — антисептики, оказывающие антимикробное действие: 70% этиловый спирт, спиртовой 5% раствор йода, растворы хлорамина (0,5-2%), формалина (0,5-1%), перманганата калия (0, 1%), 1-2% растворы метиленового синего или бриллиантового зеленого и т.п. (например, местная обработка йодом в хирургической терапии).
Дезинфекция — обеззараживание объектов окружающей среды с помощью химических веществ: хлорная известь (0,1-10%), хлорамин (0,5-5%), фенол или карболовая кислота (3-5%), лизол (3-5 %) и т.д. (например, обработка предметов: полов, стен и т.д., включение бактерицидной лампы).
Стерилизация является одним из важнейших и необходимых приемов в биотехнологической и микробиологической практике. Культивирование организмов проводится обязательно в стерильных условиях. Под стерилизацией или обеззараживанием понимают полное уничтожение живых микроорганизмов и их покоящихся форм (спор) в питательных средах, посуде, сухих материалах, инструментах и других предметах лабораторного оборудования. По характеру действия методы стерилизации в биотехнологии и не только, делятся на физические, механические и химические.
Физические методы стерилизации:
- прокаливания в пламени;
- стерилизация сухим жаром (горячим воздухом в сушильном шкафу)
- стерилизация кипячением;
- стерилизация насыщенным паром под давлением (автоклавирование);
- дробная стерилизация (тиндализация).
- стерилизация ультрафиолетовым облучением.
Химические методы стерилизации: дезинфекция антисептиками.
Механический метод стерилизации: фильтрация с помощью мембранных фильтров и фильтров Зейтца.
Возможность и целесообразность применения того или иного способа определяется особенностями материала, подлежащего стерилизации, его физическими и химическими свойствами, целью исследования. Чаще всего в биотехнологии и микробиологической практике применяется термическая стерилизация.
1. Физические методы стерилизации
1.1. Термическая стерилизация:
1.1.1. Стерилизация обжигом в пламени горелки
Небольшие стеклянные и металлические предметы (игла, петля, пинцет, скальпель, палочки, шпатель) стерилизуют прокаливанием в пламени непосредственно перед использованием. Стерилизация достигается обугливанием микроорганизмов, находящихся на их поверхностях. Обжигом в пламени пользуются для стерилизации поверхности ватных пробок, горла посуды.
1.1.2. Стерилизация в автоклаве паром под давлением
Самый надежный и универсальный метод стерилизации питательных сред и материалов — стерилизация их насыщенным паром под давлением выше атмосферного. Повышенное давление пара создается в специальных герметичных толстостенных аппаратах (автоклавах). Предметы, подлежащие стерилизации в автоклаве, заворачивают в бумагу. Полная стерилизация многих питательных сред обеспечивается нагреванием в течение 15-20 минут при 120°С и избыточного давления 1 атм., Сред с углеводами — 15 минут при 0,5 атм., Обеззараживания инфицированного материала проводят 20-25 минут при 1,5 — 2 атм.
| Давление пара, атм. | Температура, °С | Длительность стерилизации, мин. |
|---|---|---|
| 0 | 100 | 30–60 (дробно) |
| 0,5 | 111 | 10–30 |
| 1 | 121 | 15–20 |
| 1,5 | 127 | 15–20 |
| 2 | 133 | 15 |
1.1.3. Стерилизация кипячением
Стерилизацию металлических инструментов, предметных стекол, резиновых трубок и др. проводят кипячением. Споры некоторых бактерий сохраняют жизнеспособность при кипячении. Рекомендуется стерилизацию кипячением проводить в 2%-ым растворе карбоната натрия (для смягчения воды и увеличения температуры кипения) не менее 30 мин.
1.1.4. Стерилизация сухим жаром (печь Пастера)
Сухим жаром стерилизуют в основном стеклянную посуду. Чтобы избежать заражения предметов простерилизованные, с воздуха, их перед стерилизацией заворачивают в оберточную бумагу и вынимают из нее только перед работой. Метод предусматривает бактерицидное действие нагретого воздуха до 165-180ºС, при большей температуре будет идти обугливания бумаги в который завернут посуду.
1.1.5. Стерилизация текучим паром (автоклав или аппарат Коха)
Питательные среды с углеводами и витаминами, молоко, солод, желатина и другие объекты, которые портятся от воздействия сухого жара, подвергают стерилизации текучим паром. Стерилизации текучим паром производят кипятильнике Коха или в автоклаве с открытым вентилем. Воду в них доводят до кипения, и образующийся пар, обтекает объекты. Температура питательных сред, стерилизуются, достигает 100 ° С (80-90 ° С). Нагрев течение 20-45 минут приводит к гибели вегетативных клеток бактерий, но споры их не погибают. На следующий день нагрева повторяют. В этих условиях погибают вегетативные клетки, развивающиеся из спор. Для обеспечения полной стерильности жидкость оставляют еще на сутки и снова повторяют нагревание.
1.1.6. Тиндализация
Дробная стерилизация при 56-58°С в течение 1 часа 5-6 суток подряд. Применяется для веществ, легко разрушаются — сыворотка крови, растворы витаминов и т.п.
1.1.7. Пастеризация
В основе пастеризации лежит нагревание жидкостей до температуры менее 100°С. Цель ее — уничтожение безспоровых бактерий в жидкостях, теряют питательные свойства при кипячении (молоко, пиво, вино и др.).. Осуществляется пастеризация нагреванием жидкостей при 50-65°С в течение 15-30 минут, или при 70-80°С в течение 5-15 минут с последующим быстрым охлаждением.
1.2. Холодная стерилизация
Бактерицидное ультрафиолетовое облучение.
Предметы, изготовлены из термолабильных пластмасс, например, центрифужные пробирки, стерилизуют ультрафиолетовыми лучами (длина волны 260-300 мкм) в боксах специальных. Время облучения устанавливают экспериментально. Оно зависит от мощности бактерицидной лампы и расстояния между лампой и объектом.
2. Механическое фильтрование
Органические жидкости не выносят нагревания, освобождают от бактерий, пропуская через стерильные мелкоячеистая фильтры. Эти фильтры задерживают микроорганизмы, их называют бактериальными фильтрами. Широко применяются асбестовые и мембранные фильтры с различным диаметром пор. Применяются также фарфоровые (из кварцевого песка и каолина), стеклянные и фильтры с инфузорной земли (с диатомита или кизельгура). Фильтры выпускаются под номерами и марками. Асбестовые фильтры выпускаются с диаметром 35 и 140 мм, различают фильтрующую и стерилизуя марки. Мембранные фильтры (с нитроклетчатки или ацетилцеллюлозы) имеют номера 1-5, соответственно размеры пор 350-1200 нм. Перед употреблением мембранные фильтры стерилизуют кипячением или в автоклаве. Фильтры помещают в теплую дистиллированную воду и кипятят 30 минут, меняя ее 2-3 раза.
3. Химическая стерилизация
Применяются химические дезинфицирующие вещества. Обычно носит не предсказуемый результат для продуцентов и конечных продуктов, не имеет широкого применения в биотехнологических производствах.