Микроскопирование — техника изготовления временных «прижизненных» и «фиксированных» препаратов
Метод «роздавленої краплі»
На чисте знежирене предметне скло мікробіологічною петлею наносять краплю суспензії м/о. Якщо в культурі розвилося дуже багато бактерій, її розводять водою. Покривне скло ставлять на ребро з краю краплі і поступово опускають на неї. Між скельцями не повинно залишатися пухирців повітря, які заважатимуть мікроскопії. Крапля повинна бути невеликою, щоб після «роздавлення» рідина не виступала за край покривного скла. Препарат розглядають із сухою системою.
Метод «висячої краплі»
Препарат «висяча крапля» використовують для виявлення рухливості м/о. Крім того, можна довгостроково спостерігати за життєдіяльністю м/о: розмноженням, утворенням і проростанням спор.
Для готування препарату невелику краплю суспензії м/о наносять на покривне скло, перевертають його краплею вниз і поміщають на спеціальне предметне скло з поглибленням (лункою) у центрі. Крапля повинна вільно висіти, не торкаючись країв і дна лунки. Край лунки попередньо змазують вазеліном. Крапля виявляється герметично замкненої у вологій камері, що дозволяє багатоденне спостерігання за об’єктом.
Препарати розглядають під мікроскопом, злегка затемнюючи поле зору; конденсор трохи опускають, надходження світла регулюють увігнутим дзеркалом. З невеликим збільшенням знаходять край краплі, що буде чітко видний у затемненому полі зору. Край краплі пересувають у центр полю зору мікроскопа і переводять на велике збільшення, розширивши при цьому діафрагму. Більш чіткі результати можна одержати у мікроскопії у темному полі чи у фазовому контрасті.
Препарат «відбиток»
Ці препарати є зручними для вивчення природного розташування кліток у колонії м/о й особливо для дослідження форми спор і спороносців актиноміцетів і грибів.
З агаризованої пластинки, на якій м/о виросли суцільним газоном, вирізають скальпелем невеликий блок і переносять на предметне скло так, щоб поверхня з м/о була звернена нагору. Потім до газону прикладають чисте покривне скло і негайно знімають, намагаючись не зрушити убік. Отриманий препарат поміщають відбитком униз у краплю води (можна в краплю метиленового синього) на предметне скло і розглядають під мікроскопом із сухою системою. Такий відбиток можна одержати і на предметному склі, якщо торкнутися поверхні колонії предметним склом. Відбитки можна фіксувати й забарвлювати будь-яким способом.
Фіксований та забарвлений мазок мікроорганізмів.
Дослідження фіксованих забарвлених препаратів – найбільш розповсюджений мікробіологічний метод для виявлення морфологічних особливостей, кількісного обліку м/о, а також для перевірки чистоти культури. Фіксовані забарвлені препарати можуть зберігатися тривалий час і розглядаються з імерсією. Їх готування вміщує наступні етапи: виконання мазка, висушування, фіксацію й забарвлення.
У простому забарвленні м/о застосовують якийсь один з основних анілінових барвників: метиленовий синій, основний фуксин, генціановий фіолетовий, кристалічний фіолетовий. Профарбовується вся клітина.
Готування мазка. За допомогою стерильної бактеріологічної петлі чи піпетки нанести на знежирене предметне скло краплю суспензії мікроорганізму. Матеріал із густого живильного середовища взяти бактеріологічною петлею і внести його в краплю стерильної водопровідної води. Матеріал рівномірно тонким шаром розподілити на площі 1-2 см2.
Висушування мазка. Висушити приготовлений мазок при кімнатній температурі у повітрі. Тонкий мазок висихає дуже швидко. Якщо висушування мазка уповільнене, препарат можна злегка нагріти в струмені теплого повітря, тримаючи предметне скло високо над полум’ям пальника мазком нагору. Цю операцію проводять дуже обережно, не перегріваючи мазка, інакше клітини мікроорганізмів деформуються.
Фіксація. Фіксація переслідує кілька цілей: забезпечити прикріплення кліток до скла; зробити мазок більш сприйнятливим до забарвлення, оскільки мертві клітини забарвлюються краще, ніж живі; зробити безпечним подальші маніпуляції з мазком, що важливо в роботі з патогенними мікроорганізмами. Найпростіший і розповсюджений спосіб фіксації — термічна обробка. Після висушування мазок зафіксувати в полум’ї пальника. Тримаючи скло мазком нагору, тричі провести його через гарячу частину полум’я пальника. Щоб уникнути перегріву, час прямого впливу полум’я не повинний перевищувати 3-4 с. Крім жару фіксацію можна робити хімічними речовинами, для цього використовують 96%-ний етиловий спирт (час фіксації 5-10 хвилин), суміш Нікіфорова (спирт: ефір – 1:1; час фіксації 10-15 хвилин); ацетон (5 хвилин) та ін.
Забарвлення. Фіксований препарат помістити мазком нагору на місток із двох паралельних скляних паличок, з’єднаних гумовими трубками, що знаходяться на стінках кювети чи кристалізатора. Нанести на нього 2-3 краплі барвника (кінець піпетки не повинний торкатися мазка!) на 2-3 хв. Під час забарвлення розчин барвника на мазку не повинний підсихати, при необхідності доливати нові порції. Для одержання більш чистих препаратів барвник наливають на мазок, покритий фільтрувальним папером. По закінченні фарбування препарат промивають водою доти, поки стікаюча вода не стане безбарвною. Потім препарат висушують у повітрі і промокають фільтрувальним папером та виконують мікроскопію з імерсією фіксованого та забарвленого препарату мікроорганізму.
Після роботи кедрову олію негайно видаляють з об’єктива серветкою, що змочена очищеним бензином. Ксилол і спирт використовувати не рекомендується, тому що вони можуть викликати розклеювання лінз об’єктивів.
У правильно забарвленому і добре промитому препараті поле зору залишається світлим і чистим, а пофарбованими залишаються клітини мікроорганізмів.