Данная работа посвящена разработке комплексной методологии оценки концентрационных характеристик высокомолекулярных и низкомолекулярных белков.
В биотехнологии существует проблема разработки и внедрения оптимальных методов скрининга, выделения, определения концентрации, а также полностью не решена задача селективной оценки биологически активных веществ, которые содержатся в минорных количествах. Для количественной оценки целевого продукта белковой природы проведены исследования сывороточных белковых компонентов унифицированными полумикрометодами.
В работе разработана технология, позволяющая индуцировать экспрессию антителообразования и синтеза цитокинов на экспериментальной модели иммунизированных животных (лабораторных крыс породы Вистар). Использованы различные современные приемы определения концентрации цитокинов, иммуноглобулиновых антител и белков различной молекулярной массы.
Материалом служат биологические жидкости -сыворотка крови, обогащенная провоспалительными цитокинами: интерлейкином-2, интерлейкином-3, интерлейкином-4, интерлейкином-8 (ИЛ-2, ИЛ-3, ИЛ-4, ИЛ-8).
Сывороткой, содержащей избыточное количество провоспалительных цитокинов, четырехкратно иммунизировали лабораторных крыс породы Вистар. Иммунизацию проводили с интервалом 48 часов путем внутрибрюшинного введения 0.2 мл сыворотки, содержащей ИЛ-2, ИЛ-3, ИЛ-4, ИЛ-8. Забой животных производили через 48 часов после последней иммунизации методом декапитации и осуществляли забор крови для получения плазмы (гепаринизированная кровь) и для получения сыворотки — кровь без консервантов.
В работе проводились исследования содержания иммуноглобулиновых антител в нативной сыворотке крови и сыворотке после иммунизации животных турбометрическим методом на иммуноферментном анализаторе. Обнаружили увеличение концентрации иммуноглобулинов класса А, М, G.
Исследования концентрационных изменений цитокинов в сыворотке крови интактных и иммунизированных животных с помощью моноклональных антител методом люминесценции. Обнаружили повышение концентрации ИЛ-4, ИЛ-8 под действием миастогенных факторов и увеличение ИЛ-2, ИЛ-3 под действием цитотоксических факторов.
Исследование белковых фракций экспериментальных животных методами электрофореза на пленках из ацетата целлюлозы и электрофореза в полиакриламидном геле. Оба метода электрофореза показали, что иммунизация животных значительно изменяет соотношение фракций, а именно достоверно уменьшилась альбуминовая фракция и увеличилась g-глобулиновая.
Использованная методика позволяет выявить достоверные отличия между контрольными и экспериментальными точками животных по всем исследуемым показателям.
Получены новые данные об использовании комплекса исследовательских методов для оценки концентрации целевого продукта, в том числе для биотехнологических производств.
Внедрение этих методов демонстрирует возможность системного и дискретного подходов анализа белков различной комформации и молекулярной массы.
Источник: Оценка концентраций продукта белковой природы / Звягинцева О.В, Климова Е.М // Біотехнологія. Наука. Освіта. Практика: тези доповідей IV Міжнародної науково-практичної конференції (Дніпропетровськ, 11 – 13 листопада 2008 р.) – Дніпропетровськ, 2008. – С. 22