Вы здесь

Определение дегидрогеназной активности гриба Blakeslea trispora

Голосов еще нет
Blakeslea trispora

Альтернативный метод определения дегидрогеназной активности мукоровых грибов Blakeslea trispora

Определение дегидрогеназной, липазной и фитазной активности каротиносинтезирующих грибов последнее время все больше вызывает интерес у исследователей разных стран мира. Однако, методики определения ферментативной активности требуют использования дорогого оборудования и поддержания специфических условий при проведении исследований. Поэтому нами использовалась альтернативная методика определения дегидрогеназной акивности с использованием метиленового синего. Этот краситель, например, для идентификации базофилов (одной из фракций лейкоцитов крови), для определения физиолого-биохимической зрелости дрожжевых клеток, клеток мукоровых грибов, бактерий, в гистологии и т.п. Метиленовая синь блокирует дыхательную цепь передачи электронов, вытесняя из него структурно подобные аналоги-цитохромы. Поскольку дыхательная активность на протяжении жизненного цикла клетки изменяется, постепенно угасая, то и интенсивность блокирования дыхательной цепи метиленовой синью будет разной. Этот эффект стали использовать достаточно давно (более тридцати лет назад) для характеристики физиологического состояния продуцента олеандомицина и других микроорганизмов, в частности для определения количества живых, мертвых или молодых, старых и ослабленных клеток, или для установления степени гетерогенности популяции в закрытых емкостях.

Точное определение оптимальной физиологической зрелости посевного материала дает возможность решить ряд технологических проблем микробиологических производств:

  • упростить длительность процесса инокуляции, тем самым уменьшив энергозатраты производства;
  • уменьшить количество посевного материала для засева питательных сред на последующих стадиях технологического процесса (ферментация), использовав остатки инокулята для засева дополнительных ферментеров;
  • получить высшей выход целевого продукта (как по биомассе, так и по целевому метаболиту).

Результаты экспериментов по определению дегидрогеназной активности в пробах инокулята, отобранных из маточных колб и посевных аппаратов позволили прийти к следующим выводам:

  • Плюс половая форма гриба развивается более интенсивно, чем минус форма. Поэтому разнополые штаммы желательно выращивать в течение различных сроков выращивания: Эти выводы подтверждаются как для культуры, выращенной в колбах, так и для инокулята в посевных аппаратах.
  • Такая разница в сроках выращивания разнополой инокулята характерна для штаммов, полученных методом классической селекции, однако для штаммов, к которым применили GS-селекцию, эта тенденция не подтвердилась - созревание "+" и "-" штаммов у них происходит более синхронно-протяжении 29 - 32 часов. Это значительно облегчает работу с этими штаммами и повышает их технологичность.
  • Физиологически активный мицелий, как показали методы микроскопии, имеет цитозоль мелкозернистой структуры, близкой к гомогенной консистенции. Такой мицелий окрашивается метиленовым-синим в светло-голубой цвет неодинаково интенсивности.
  • Физиологически активный инокулят находится в экспоненциальной фазе развития (II фаза роста)
  • Грибы, который обладает высокой дегидрогеназною активностью, более быстро обесцвечивается на свету, то есть более стремительно теряет синее окрашивание, свойственное красителя, и приобретает серо-бежевый цвет.
  • При отстаивали в пробирках инокулят расслаивается таким образом, что физиологически активный мицелий с высокой дегидрогеназною активностью всплывет на верх, а более молодой, недозрелый мицелий оседает на дно. Это еще раз подтверждает тот факт, что популяция клеток в закрытой емкости является гетерогенной.

Таким образом, косвенное определение дегидрогеназой активности клеток гриба Blakeslea trispora может служить альтернативным методом контроля процесса производства каротиноидов. Этот метод можно рассматривать как дополняющий к методам, предусмотренных схемой контроля производства (комплекс гравиметрических и микробиологических методов). Кроме этого, его можно использовать для исследовательских целей, например, для обоснования количества необходимого посевного материала, для физиологических исследований и т.п. Несомненными преимуществами этого метода является простота выполнения, экспрессивность, невысокая стоимость реагентов и другого материального обеспечения, которые используются.

Автор фото (Blakeslea trispora): Бондарь И.В.

Источник: Cировнєв Г.І., Бондар І.В. Альтернативний метод визначення дегідрогеназної активності мукорового гриба Blakeslea trispora / Биотехнология сборник

Комментарии

Метод определения с метилен. синью - замечательно и, по-видимому, просто. Но где найти Вашу методику, дорогие авторы, сообщите. Может и я смогу с вами чем-то поделиться. Спасибо..
Уважаемая Елизавета, обратитесь к Бондарь Ирине Владимировне. Она является главным микробиологом ООО «НПП« Витан» и доцентом Днепродзержинского технического университета.

Добавить комментарий