Оптимизация условий культивирования каллусных культур с использованием матрицы планирования эксперимента. Получение субкультур высших растений, несмотря на кажущуюся в некоторых случаях легкость – процесс сложный и многоэтапный. Он предполагает адаптацию клеток к резко изменившимся условиям существования и формирование новой биологической системы, в которой клетки, выполнявшие в организме лишь некоторые, определенные функции, приобретают свойства отдельных организмов, способных к автономному развитию. При этом в ряде случаев перед исследователями встает задача коррекции созданных условий культивирования, определение удачной системы, в которой полученные при дедифференциации специализированные клетки будут обладать способностью к неограниченному росту, и, в зависимости от задач исследования, видоспецифичным синтезом вторичных метаболитов либо тенденцией к проявлению морфогенетической реакции [21].
Для достижения поставленной цели во многих случаях прибегают к оптимизации условий культивирования по ряду факторов. При этом в поле зрения исследователей попадают химические (состав питательной среды – органический, минеральный, гормональный, значение рН, внесение различных предшественников целевых продуктов и т.д.), физические (интенсивность освещения, температура, наличие различных типов ионизирующих и неионизирующих излучений и полей) и даже биологические (введение в среду культивирования различных ферментов, генов, вирусных и бактериальных частиц) факторы.
Наиболее распространенным методом оптимизации питательной среды является ее модификация по органическому и минеральному составу. И все чаще в настоящее время исследователи прибегают к методам математического моделирования поведения биологических объектов при изменении тех или иных факторов среды обитания [99, 100]. Этот метод нашел свое применение и в культуре тканей растений. Путем модификации среды с применением методов математического планирования эксперимента оптимизированы условия культивирования и получения веществ специализированного обмена для десятков видов. Это позволило не только повысить скорость нарастания биомассы, но и увеличить продуктивность культивируемых тканей [6, 10, 11, 24, 29, 34, 43, 62, 92, 93, 97, 116, 136, 171, 173, 183, 250].
Многочисленные литературные данные свидетельствуют об отсутствии универсального варианта питательной среды, пригодного для длительного субкультивирования и получения стабильных клеточных культур. Для уменьшения количества эмпирических исследований и целенаправленного поиска оптимального варианта питательных сред, позволяющих полнее реализовать потенциал культур тканей целесообразно использовать методы планирования эксперимента.
При оптимизации питательных сред часто используют способ математического планирования эксперимента, предложенный В. Н. Максимовым и В. Д. Федоровым, который после проведения первой серии опытов требует постановки второй серии опытов [99, 100]. В. П. Малышевым был разработан способ оптимизации химико-технологическо процесса, не требующий постановки второй серии опытов [102]. В. А. Смирновым с соавторами было проведено сравнение эффективности двух вышеуказанных способов в эксперименте по оптимизации состава питательной среды для культур клеток томатов. При использовании первого метода концентрации регуляторов роста находились либо в стимулирующей, либо в ингибирующей области концентраций, в результате чего не удалось получить оптимальный вариант питательной среды. Для оптимизации состава питательной среды было необходимо проведение второй серии опытов. Использование же второго метода позволило авторам разработать состав питательной среды по результатам одной серии опытов [156]
Недостатками метода В. П. Малышева, а также метода В. Н. Максимова и В. Д. Федорова является то, что ход кривых, полученных в результате эксперимента, носит только количественный характер и не отражает качественных изменений происходящих в биологических объектах при переходах от более высоких концентраций факторов оптимизации к низким. Однако, при дополнении этого способа оптимизации методами оценки качественных изменений, происходящих в биологических объектах, возможно создание удачной системы оптимизации состава питательных сред для культивирования in vitro растительных эксплантов, что было показано в работах Г.А. Зелениной [61]. В таблице 3.3 представлена итоговая матрица состава экспериментальных питательных сред для оптимизации культивирования каллусных тканей C. vitalba.
В таблицах 3.4 и 3.5 представлены экспериментальные данные по влиянию состава сред и условий культивирования (на свету или в темноте) на частоту каллусообразования, накопление сырой и сухой биомассы и величину ростового индекса полученных тканей.
Анализ полученных экспериментальных данных показал, что культивирование на питательных средах в темноте повышает продуктивность прироста биомассы как по накоплению сырого, так и сухого вещества.
Как свидетельствуют данные представленные в таблице 3.4, при культивировании в условиях освещения вариантами сред, позволяющими получать максимальный выход как сырой, так и сухой биомассы, являлись варианты питательных сред № 3, 11, 12, 10.
Для питательных сред № 15, 20, 21 отмечены минимальные показатели накопления биомассы, как на сухой, так и на сырой вес.
Данные, приведенные в таблице 3.5, свидетельствуют о том, что при культивировании в темноте максимальные показатели продуктивности каллусов на питательных средах отмечены для вариантов № 1, 3, 11, 12 и 13.
Минимальные показатели (РИ не выше 10 как на сухой, так и сырой вес) продуктивности при культивировании в темноте отмечены для целого ряда вариантов питательных сред: №4, 5, 7, 8, 17, 18, 19, 20, 24, 25. Интересным является тот факт, что оптимизированные для выращивания каллусов питательные среды не являются оптимальными для индукции каллусообразования. Данные, приведенные в табл. 3.4 и 3.5, свидетельствуют о том, что максимальные значения РИ чаще отмечены для тех питательных сред, на которых частота каллусообразования составляла около 80-93%, а максимальные значения частоты каллусообразования на тех питательных средах, на которых РИ был не выше 4-10. Исключение составляет среда № 12 при культивировании на свету и среда № 3 при культивировании в термостате – для этих вариантов питательных сред как показатель частоты каллусообразования, так и показатель РИ находился на очень высоком уровне.
Анализ данных представленных в таблицах 3.4 и 3.5, позволил установить, что средние показатели частоты каллусообразования при культивировании эксплантов в условиях освещенности составляли 83,6 %, конечная масса десяти каллусов на сырой вес биомассы – 719,1 мг, а на сухой вес – 84 мг. При культивировании на свету ростовой индекс в пересчете на сырой вес составил 39,3, а на сухой вес каллуса – 16,4 отн. ед. массы.
При культивировании каллусов в темноте средние показатели частоты каллусообразования при культивировании эксплантов в условиях освещенности составляет 84,2 %, конечная маса десяти каллусов в пересчете на сырой вес – 907,2 мг, а на сухой вес – 86,2 мг. При культивировании каллусов на свету ростовой индекс расчитанный на сырой вес каллуса составил 45,3, а на сухой вес – 17,2 отн. ед. массы.
Таким образом, в заключение можно сказать, что как для индукции каллусообразования, так и для повышения продуктивности использованных питательных сред следует культивировать каллусные культуры C. vitalbaв темноте, что способствует повышению не только частоты каллусообразования у введенных в условия invitroэксплантов, но и нарастанию биомассы культивируемых каллусов.
Ссылки на литературу в тексте соответствуют источнику Индуцированный морфогенез in vitro и накопление тритерпеновых гликозидов в каллусных культурах ломоноса виноградолистного (Clematis vitalba L.)
Содержание таблиц также находится в источнике. Источник: Сидякин А.И., Индуцированный морфогенез in vitro и накопление тритерпеновых гликозидов в каллусных культурах ломоноса виноградолистного (Clematis vitalba L.): Дис. … канд. биол. наук. Симферополь. 2011. – 217 с.
Материал любезно предоставил Сидякин Андрей Иванович – к.б.н., ас. каф. ботаники и физиологии растений и биотехнологий и м.н.с. Биотехнологического центра НИЧ Таврического национального университета им. В.И. Вернадского, научный консультант ООО КрымБио