Особенности механической и энзиматической изоляции зародышевых мешков и зародышей кукурузы (Zea mays L.)
В статье описаны особенности механической и ферментативной изоляции зародышевых мешков и зародышей на ранней эмбриональной стадии с целью их дальнейшего использования в работах по искусственному оплодотворению и эмбриогенезу in vitro у кукурузы.
В изучении процесса репродукции у растений in vitro в настоящее время достигнут значительный прогресс, который позволяет в генеративных структурах, изолированных от растительного организма, успешно осуществлять процессы гаметогенеза, опыления, оплодотворения, эмбриогенеза и эндоспермиогенеза [1, 4, 5, 7]. Совершенствование техники изоляции мужских и женских гамет, их слияние и эмбриогенез in vitro из полученных в результате искусственного оплодотворения зигот открывают широкие перспективы для изучения механизма двойного оплодотворения и оценки экспрессии трансгенов в зависимости от типа гамет [7]. Изоляция репродуктивных структур необходима для оплодотворения in vitro, эмбриокультуры, преодоления естественных барьеров несовместимости и преодоления стерильности при отдаленной гибридизации и других биотехнологических и селекционных программах [2].
Собственно процесс оплодотворения и особенно ранние этапы развития зародыша и эндосперма in vivo проходят при глубоком погружении в ткани материнского организма — нуцеллуса и интегументов, которые после оплодотворения формируют соответственно перисперм (в определенных видов) и семенную оболочку. Искусственное же оплодотворение in vitro предусматривает изоляцию гамет и их принудительное слияние in vitro [3]. Данная техника состоит из нескольких этапов, которые вместе позволяют эффективно осуществлять этот сложный природный процесс. Этими этапами являются изолирование зародышевых мешков и яйцеклеток, изолирование спермиев, слияние гамет in vitro, культивирование зигот и зиготусодержащих зародышевых мешков, культура молодых зиготических зародышей и эндосперма.
В настоящее время технологии изоляции репродуктивных структур кукурузы разработаны недостаточно, отсутствуют данные относительно корреляции динамики развития зерновок, зародышевых мешков, зародышей и эндосперма у разных генотипов. Отсутствие четких, надежных методик изоляции репродуктивных структур кукурузы обусловливает несовершенство процесса слияния в искусственных условиях яйцеклеток со спермиями и развития проэмбрио in vitro.
В связи с актуальностью техники изоляции репродуктивных структур, неразработанностью вопросов в области технологии искусственного оплодотворения и эмбриогенеза целью нашей работы было совершенствование методики изоляции зародышевых мешков и молодых зародышей кукурузы. Оптимизация техники изолирования именно этих структур не только готовит базу для разработки техники искусственного оплодотворения, но и обеспечивает возможность культивирования изолированных незрелых зародышей, начиная с первых этапов развития.
Для достижения цели были поставлены задачи провести морфометрические исследования зародышевых мешков, зерновок и початков, в период с 1 — 10 сутки после опыления, установить коэффициенты парной корреляции между морфометрическими показателями, характеризующих зародышевый мешок, зерновку и початок после опыления, рассчитать уравнения регрессии между морфометрическими показателями, исследовать влияние целлюлазы в концентрациях 1%, 2%, 3%, 4%, температурной обработки в диапазоне 20°С и 35°С и экспозиции ферментативной и температурной обработки на степень мацерации тканей молодой зерновки кукурузы.
При работе в качестве объекта исследования был использован гибрид кукурузы Днепровский 310, семена которого была любезно предоставлена отделом селекции Института зернового хозяйства УААН. Кукуруза — одна из важнейших сельскохозяйственных культур. Кукуруза — культура высокой продуктивности и разностороннего использования. Кукуруза используется как кормовая, пищевая и техническая культура. Интерес этой культурой объясняется высокими кормовыми качествами зерна и значительным преимуществом ее урожайности по сравнению с другими зерновыми культурами [6].
Для изоляции репродуктивных структур кукурузы использовали механическое выделение под микроскопом и выделение с помощью ферментативной обработки. Зародыши удаляли надавливанием покровного стекла на предметное, где находился зародышевый мешок в капле воды. Для мацерации тканей использовали фермент целлюлазу в концентрациях в зависимости от варианта опыта 1, 2, 3, 4% с экспозицией 10; 15; 20 мин. и температурой — 20°С и 35°С. Для этого зародышевый мешок помещали в 0,2 мл фермента определенной концентрации на соответствующее время при определенной температуре.
В результате исследования установлено, что между диаметром початка и длиной зародышевого мешка существует линейная зависимость, характеризующаяся коэффициентом корреляции r = 0,96 (достоверный на уровне значимости 0,05) и уравнением регрессии y = ─ 1,03 + 0,07 x, где в — длина зародышевого мешке, х — одна из морфометрических характеристик зерновки. Между длиной зерновки и длиной зародышевого мешка также установлено линейную зависимость, характеризующаяся коэффициентом корреляции r = 0,72 (достоверный на уровне значимости 0,05) и уравнением регрессии у = ─ 0,46 + 0,24 x. Между шириной зерновки и длиной зародышевого мешка зависимость также линейна и характеризуется коэффициентом корреляции r = 0,76 (достоверный на уровне значимости 0,05) и уравнением регрессии y = ─ 0,44 + 0,25 x.
Выявлено, что для мацерации тканей молодой зерновки является оптимальным использование целлюлазы в концентрации 4% при температуре 35°С и экспозиции 15 минут.
Разработанные методы выделения репродуктивных структур кукурузы позволяют выделять зародышевые мешки и зародыши на ранней эмбриональной стадии.
Описаны особенности изоляции зародышевых мешков и установленные зависимости между морфометрическими характеристика зерновок и зародышевых мешков являются экономически целесообразными, поскольку позволяют значительно уменьшить время при выборе необходимых размеров початков и зерновок в полевых условиях, с целью последующего удаления из них зародышевых мешков.
- Батыгина Т.Б. Хлебное зерно: Атлас. – Л.: Наука. Ленинград. отд., 1987. – 103 с.
- Мельничук М.Д., Новак Т.В., Кунах В.А. Біотехнологія рослин: Підручник – К.: ПоліграфКонсалтинг, 2003. – 520с.
- Мусієнко М.М. Фізіологія рослин: Підручник. – К.: Либідь, 2005. –808 с.
- Сатарова Т.Н. Искусственное оплодотворение у кукурузы и перспективы его использования // Вісник Дніпропетровського університету. Сер. Біологія. Екологія. – 2006. – №4. – С.172 – 176.
- Шевелуха В.С., Калашникова Е.А., Воронин Е.С. и др. Сельскохозяйственная биотехнология. – М.: Высшая школа, 2003. – 469с.
- Циков В.С. Технология, гибриды, семена. – Днепропетровск: Институт кукурузы, 1995. – 68 с.
- Okamoto T., Scholten S., Loerz H., Kranz E. Identification of genes that are up- or down-regulated in the apical or basal cell of maize two-celled embryos and monitoring their expression during zygote development by a cell manipulation and PCR-based approach // Plant and Cell Physiology. – 2005. – Vol.46. – P.332 – 338.
- Робота виконана за підтримки Державного фонду фундаментальних досліджень, грант № Ф25/581 – 2007.
Источник: Ляпустіна О. В. Особливості механічної та ензиматичної ізоляції зародкових мішків та зародків кукурудзи (Zea mays L.) / О. В. Ляпустіна, Т. М. Сатарова, Н. В. Заколесник, О. В. Українець // Актуальні питання науки та практики: досягнення та перспективи – 2007: збірник наукових праць Міжнародної науково-практичної конференції (Полтава, 3 – 7 грудня 2007 р.) – Полтава, 2007. – С. 116-118.
Автор фото в статье: Ляпустина Е.В.