Для получения первичных каллусных культур и индукции морфогенеза экспланты высаживали на базовые агаризованые (0,7-0,8 % агара «Difco») питательные среды Мурасиге и Скуга (МС) [220], Гамборга и Эвелега (В5) [201], Лина и Стабы (LS) [215] (таблица 1), которые модифицировали по составу регуляторов роста и органическим компонентам.
В качестве регуляторов роста использовали:
- 2,4-дихлорфеноксиуксусную кислоту (2,4-Д) (Sigma, США) – 0,5-5,0 мг/л;
- b-индолил-3-уксусную кислоту (ИУК), (Serva, Германия) – 0,1-1,0 мг/л;
- 6-бензиламинопурин (БАП) (Sigma, США) – 0,5-1,0 мг/л.
В качестве основного источника углерода использовали сахарозу в концентрации 10-50 г/л. рН питательных сред перед автоклавированием доводили до 5,5-5,8 при помощи 0,1 н НCl или 0,1 н КОН.
Для культивирования эксплантов и каллусных культур использовали пробирки 15(16)×150 мм с 10 мл питательной среды, пробирки 20×200 мм с 25-30 мл питательной среды или культуральные сосуды объемом 100-250 мл с 50 мл питательной среды. Как правило, в один культуральный сосуд помещали один эксплант при средней выборке 30. Масса экспланта при субкультивировании каллусных культур составляла 150-200 мг. Культивирование эксплантов и каллусных культур осуществляли в культуральной комнате на фитолюминостатах типа ФЛС-8 (НПО «Биоритм», Украина), с интенсивностью освещения 2-5 клк при 12-16 часовом фотопериоде, или условно в темноте – в отсутствии длительного освещения (в термостатах ТС-80 (УССР)), при температуре 26-28 0С и относительной влажности воздуха 70 %.
Таблица 1 — Состав базовых питательных сред используемых для культивирования каллусных культур Clematis vitalba
При исследовании особенностей каллусообразования определяли частоту каллусообразования и ростовой индекс. Частоту каллусообразования определяли как число эксплантов, образующих каллус, от общего числа эксплантированных в процентах. Ростовой индекс (РИ), как показатель продуктивности питательных сред (по конечной накопленной биомассе), определяли как отношение конечной массы трансплантата к начальной его массе в относительных единицах (рассчитывали как для сырой, так и для сухой биомасы).
Математическое планирование эксперимента при оптимизации питательных сред
Для уменьшения количества эмпирических исследований и целенаправленного поиска оптимального варианта питательных сред, позволяющих полнее реализовать потенциал культур тканей, целесообразно использовать методы планирования эксперимента [40, 62, 97, 99, 100, 250].
В биотехнологии наиболее часто используется оптимизация и планирование эксперимента по способу n-факторного эксперимента, описанные в пособиях В. Н. Максимова [99, 100], которые основываются на использовании уравнений регрессии Иейтса и оптимизации процессов по методу крутого восхождения. Недостатком данного метода является необходимость проведения нескольких серий опытов: в начале – для определения стимулирующей или ингибирующей областей значений факторов, и только затем – определения их оптимальных значений [62, 97, 99, 100, 250]. Планирование эксперимента по методике В. П. Малышева [102], в отличие от способа В. Н. Максимова и В. Д. Федорова, основано на использовании матриц, составленных по модифицированной автором формуле Протодьяконова. Данный способ значительно проще в применении, позволяет оптимизировать состав питательной среды по нескольким компонентам на нескольких уровнях концентраций за короткий период времени при небольшом количестве опытов. К достоинствам метода относится возможность оценки результатов эксперимента только по точечным графикам без обработки специальными компьютерными программами.
Данная методика основывается на усеченной матрице 6-ти или 9-ти факторного эксперимента, в котором возможно изучение соответственно 6-ти или 9-ти факторов на 5-ти или 8-ми уровнях варьирования (25 или 64 варианта в эксперименте). Структура матрицы такова, что при проведении эксперимента каждый уровень любого фактора стыкуется один раз с каждым уровнем всех остальных факторов. Этим обеспечивается усреднение действия каждого фактора при выборке результатов эксперимента на каждый уровень любого фактора, т.е. достигается тот же эффект, что и при бесконечно большом количестве экспериментов со случайной вариацией всех факторов [102].
Как известно из литературных данных, компонентами среды, влияющими на процессы каллусогенеза и накопления вторичных метаболитов, являются, в первую очередь, регуляторы роста, источники углерода, азотного и фосфорного питания [21, 23, 64]. Кроме того, не исключено влияние витаминов, как индукторов специфической ферментативной активности [135], поэтому оптимизацию питательных сред проводили для следующих факторов: 2,4-Д, БАП, сахароза, NH4NO3 и NaH2PO4, витаминный комплекс по Мурасиге и Скугу (состав: тиамин – 0,1 мг/л, пиридоксин – 0,5 мг/л, никотиновая кислота – 0,5 мг/л, аскорбиновая кислота – 10,0 мг/л, глицин – 2,0 мг/л). За минеральную основу, на основе которой будет разработана новая питательная среда, была взята среда Гамборга и Эвелега (В5).
Используя в качестве основы матрицу плана эксперимента, предложенную В. П. Малышевым, нами была составлена матрица собственных исследований (табл. 2) по оптимизации состава питательной среды для культивирования каллусных культур Clematis vitalba.
Таблица 2 — Матрица оптимизации состава питательной среды для культивирования каллуса Clematis vitalba
Примечание – В данном случае речь идет о множителе концентрации витаминного комплекса по МС
Начальный уровень варьирования концентрации таких компонентов, как сахароза, 2,4-Д, БАП, гидрофосфат натрия, без которых невозможно сохранение жизнеспособности и начало пролиферативных процессов, представлены соответствующими минимальными концентрациями, установленными в ходе собственных исследований [16, 18, 19]. Для таких компонентов, как витаминный комплекс и нитрат аммония в качестве первого уровня варьирования избрана нулевая концентрация, так как, по нашему мнению, отсутствие этих компонентов в питательной среде позволит сделать вывод о целесообразности его добавления. Кроме того, нами было решено выяснить влияние света на процессы роста, каллусообразования и накопления биомассы, для чего по 10 пробирок каждого из вариантов питательной среды культивировали либо в темноте (в термостате), либо на фитолюминостатах.
Для возможности проведения объективной оценки влияния состава питательных сред на процессы каллусообразования и накопления биомассы в культуре in vitro C. vitalba использовали однотипные экспланты – сегменты второй-третьей пары листьев растения, выращиваемого в условиях лабораторно-вегетационного опыта.
Критериями оптимизации состава питательной среды нами были выбраны следующие показатели: накопление сырой и сухой биомассы, ростовой индекс (рассчитывался как для сырой, так и сухой биомассы), морфологический тип образующегося каллуса.
Для определения оптимальных концентраций каждого компонента питательной среды по способу В. П. Малышева строили графики зависимостей величины ростового индекса полученных каллусных тканей от содержания изученных компонентов (как для сухой, так и для сырой массы в различных «свет-темнота» условях культивирования). Для построения графиков делали выборку экспериментальных значений функций у1, у2… у6 от их уровня варьирования (концентрации компонентов оптимизации в питательной среде) х1-х6, на основании которых строились графики, отражающие зависимость величины ростовых индексов каллусов C. vitalba от изменения содержания компонентов в питательной среде.
Оптимизация питательных сред для индукции каллусообразования и культивирования каллусов Clematis vitalba в культуре тканей in vitro
В настоящее время в мировой практике для интенсификации получения биомассы культур-продуцентов вторичных метаболитов все большее значение приобретает оптимизация питательных сред на основе трофических и гормональных факторов, предназначенная как для повышения частоты каллусообразования при введении в культуруin vitro, так и для интенсификации процессов получения биомассы и накопления в ней продуктов вторичного обмена [62, 97, 171, 250]. Наиболее широко при оптимизации используется варьирование в составе питательных сред таких компонентов, как регуляторы роста, концентрация и тип углеводов, витаминные комплексы, источники азотного, калийного, фосфорного питания. Нередко исследователи модифицируют среды по содержанию железа, микроэлементов, источников органических соединений азота (гидролизат казеина, дрожжевой экстракт). Кроме того, в настоящее время особый интерес вызывает введение в питательную среду сигнальных эффекторов – производных микробных полисахаридов, всевозможных элиситоров, которые не только активизируют процессы пролиферации, но и могут оказывать стимулирующее действие на накопление вторичных метаболитов [6, 10, 24, 29, 34, 183, 188, 250].
Ссылки на литературу в тексте соответствуют источнику Индуцированный морфогенез in vitro и накопление тритерпеновых гликозидов в каллусных культурах ломоноса виноградолистного (Clematis vitalba L.)
Источник: Сидякин А.И., Индуцированный морфогенез in vitro и накопление тритерпеновых гликозидов в каллусных культурах ломоноса виноградолистного (Clematis vitalba L.): Дис. … канд. биол. наук. Симферополь. 2011. – 217 с.
Материал любезно предоставил Сидякин Андрей Иванович – к.б.н., ас. каф. ботаники и физиологии растений и биотехнологий и м.н.с. Биотехнологического центра НИЧ Таврического национального университета им. В.И. Вернадского, научный консультант ООО КрымБио