Вы здесь

Получение асептической культуры Clematis vitalba

Средняя: 5 (1 оценка)
Методы стерилизации

Условия асептики и стерилизации растительного материала

При проведении экспериментов по культуре in vitro использовались общепринятые в работах по биотехнологии методики [23, 64, 108].

Для соблюдения условий асептики все работы по введению в изолированную культуру и эксперименты с каллусными тканями выполняли в условиях ламинарного бокса БП-4-005. Питательные среды, дистиллированную воду и другие вспомогательные материалы автоклавировали при 0,9-1,0 атм. (119-1210С) в течение 30 мин. в стерилизаторе ВК-30. Вспомагательное обрудование и лабораторную посуду стерилизовали сухим жаром при 180 0С в течение 60 мин. Также стерилизовались металлические инструменты, а при последующей работе в боксе их помещали в спирт и обжигали в пламени спиртовки.

В качестве первичных эксплантов использовали вегетативные апексы побега, сегменты молодых и зрелых листьевC. vitalba, которые стерилизовали с использованием коммерческого отбеливателя «Белизна-Дельфа» (Украина), содержащим 5 %-ный раствор NaClO, C2H5OH(Медасепт, Украина) различных концентраций (70-90%) и других антисептиков (3 %Н2О2 и 0,01-0,1 % KMnO4).

Этап введения в культуру in vitro является одним из самых сложных в методическом плане. Именно в этот период возникает наибольшее количество проблем, связанных с биологическими особенностями вводимого в культуру вида. Для получения пересадочных культур исследователю необходимо разработать способ стерилизации растительного материала, подобрать оптимальные условия и сроки введения в культуру, оптимизировать состав питательной среды для культивирования изолированных тканей.

Разработка способов стерилизации органов и тканей Clematis vitalba для получения асептической культуры. Как известно, при введении растительного материала в культуру in vitro необходимо соблюдение правил асептики [23, 64, 73, 166].Введение эксплантов и их дальнейшее культивирование для получения как первичного каллуса, так и растений-регенерантов невозможно без разработки методики стерилизации исходного растительного материала.Стерилизацию взятого из природных условий растительного материала необходимо проводить для освобождения от источников экзогенной и эндогенной инфекции, которые могут затруднять прохождение всех этапов эксперимента. Наиболее часто при введении в культуру in vitro исследователи используют хлор-, кислород- и спиртсодержащие растворы, которые наряду с высоким бактерицидным действием оказывают незначительное стрессовое влияние на интактные ткани [21, 60, 64, 73, 92, 134].

Для получения стерильного материала Clematis vitalba нами были испытаны несколько вариантов стерилизации. Как известно из литературных источников, данный вид растений интенсивно поражается фитопатогенными грибами [187], кроме того, высокая степень опушенности апикальной части побегов не позволяет провести тщательную стерилизацию эксплантов. Методы с применением только одного стерилизующего агента (этанола (в концентрации 70-90 %) и брадофена (с концентрацией 50-100 %) с различной экспозицией (3-15 мин)) не принесли положительных результатов. Положительные результаты были отмечены при использовании гипохлорита натрия, пермарганата калия и перекиси водорода. Для снижения травмирующего действия и достижения полноты стерилизующего эффекта нами были опробованы пять вариантов ступенчатой стерилизации исходного материала с последовательной его обработкой растворами различной концентрации NaClO (1-2,5 %) (коммерческий препарат «Белизна-Дельфа» (Украина), разбавленный дистиллированой водой 1:5, или 1:1 соответственно), 70 % этанола и активных окислителей – Н2О2 и KMnO4 (табл. 1). Стерилизацию эксплантов осуществляли по следующим схемам:

  • I – 1 % «NaClO» – 10 мин; 3 % Н2О2 – 2 мин;
  • I I – 2,5 % «NaClO» – 10 мин; 5 % Н2О2 – 2 мин;
  • III – 0,01 % KMnO4 – 30 мин; 3 % Н2О2 – 3 мин;
  • IV – 0,01 % KMnO4 – 30 мин; 70 % этанол – 1 мин; 3 % Н2О2 – 3 мин;
  • V – 0,1 % KMnO4 (+1 капля Tween-80 на 100 мл раствора) – 45 мин; 3 % Н2О2 – 3 мин.

Исходя из проведенных исследований, оптимальными способами стерилизации для данного вида являются те методы, в которых в качестве основных дезинфицирующих агентов были использованы Н2О2 и KMnO4. Как видно из данных, приведенных в таблице 1, высокий процент гибели и неэффективности стерилизации эксплантов отмечен при обработке их хлорсодержащими антисептиками (варианты Iи II), что, по-видимому, связано с высокой токсичностью данных перпаратов для этого вида растения и исследуемого типа эксплантов. При замене хлорсодержащих антисептиков на окислители (даже с низкими концентрациями рабочих растворов) резко возрастало количество полученных асептических и способных к пролиферации эксплантов (табл. 1, III).

Таблица 1 - Влияние типа экспланта и варианта стерилизации на частоту каллусообразования в культуре тканей Clematis vitalba

Кроме того, при использовании веществ, снижающих поверхностное натяжение растворов, резко возрастал выход стерильных эксплантов. Так, использование этанола, как промежуточного антисептика (путем погружения на несколько секунд), способствовало лучшему проникновению стерилизующего раствора к тканям экспланта и позволило повысить выход эксплантов свободных от контаминации (табл. 1, IV).

Низкую проникающую способность водных растворов Н2О2 и KMnO4 удалось преодолеть путем введения в стерилизующий раствор нескольких капель Tween-80 (1 капля на 100 мл раствора), что позволило получить максимальное количество стерильных апикальных частей побегов (35,7 %), высечек молодых (91,4 %) и физиологически зрелых (48,4 %) листьев (табл. 1, V).

Таким образом, представленные в таблице 1 данные показывают, что использование методики стерилизации интактного материала с применением 0,1 % KMnO4 с 1-2 каплями Tween-80 в течение 40-45-ти мин, 3 % и 0,3 % Н2О2 в течение 3-х мин позволяет получить около 35 % свободных от инфекции апикальных частей побегов, и около 92 % эксплантов высечек листовых пластинок, из которых 88-95 % способны к каллусообразованию.

Ссылки на литературу в тексте соответствуют источнику Индуцированный морфогенез in vitro и накопление тритерпеновых гликозидов в каллусных культурах ломоноса виноградолистного (Clematis vitalba L.)

Источник: Сидякин А.И., Индуцированный морфогенез in vitro и накопление тритерпеновых гликозидов в каллусных культурах ломоноса виноградолистного (Clematis vitalba L.): Дис. … канд. биол. наук. Симферополь. 2011. – 217 с.

Автор фото в статье: Ляпустина Е.В.

Материал любезно предоставил Сидякин Андрей Иванович – к.б.н., ас. каф. ботаники и физиологии растений и биотехнологий и м.н.с. Биотехнологического центра НИЧ Таврического национального университета им. В.И. Вернадского, научный консультант ООО КрымБио

Добавить комментарий