Каллусные клетки — основной объект для культивирования in vitro. Вместе с тем каллус (название происходит от греческого «мозоль») присущ и высшим растениям как один из типов тканей, участвующих в заживлении механических повреждений, и является обычной защитной реакцией целого растения. Известный ученый-ботаник Н. Кренке в середине XX в. часть своих работ посвятил изучению роли каллусной ткани в целом растении (Бутенко, 1999). Он связал ее с фазами, которые проходит каллусная ткань:
- первая фаза — быстрый рост каллусных клеток, защищающий место поражения;
- вторая фаза — запасание питательных веществ в клетках каллуса;
- третья, наиболее важная фаза — регенерация из каллусной ткани утраченных органов (корни, побеги).
В настоящее время каллусную ткань in vitro можно получить практически из любой живой ткани растения. Общими факторами, определяющими эффективность дедифференцировки ткани экспланта и развития первичного каллуса, являются:
- Генотип исходного растения. При этом сорта, линии в пределах вида могут существенно различаться.
- Эпигенетическая характеристика экспланта, в том числе однородность или неоднородность ткани за счет групп разных клеток.
- Внешние условия, из которых наиболее важны экзогенные регуляторы роста (преимущественно фитогормоны), а также вещества, действующие как средства против выделения эксплантом блокирующих каллусогенез веществ (активированный уголь, антиоксиданты).
Достаточно важным фактором для дедифференциации клеток и индукции каллусогенеза является механическое повреждение ткани экспланта. В начале 30-х годов XX в. (Бутенко, 1999) быстрое деление каллусных клеток связывали с выделением растением в связи с травмой некрогормонов (позже эти стимулирующие рост вещества получили название травматиновой кислоты). Однако необходимо заметить, что дедифференциация ткани пыльников, зародышевых органов и некоторых других объектов происходит без наружного травмирования. В этих случаях достаточно изолировать орган и перенести его в условия культуральной среды.
Следует отметить, что возникновение опухолей, вызываемых почвенной агробактерией Agrobacterium tumefaciens, тоже связано с повреждением ткани растения. Морфологически клетки опухолевой ткани также близки к каллусным. Однако метаболизм опухолевой клетки значительно отличается от каллусной, поскольку в ее геном внесены гены Ti- плазмиды бактерии, в частности гены, регулирующие синтез цитокининов и ауксинов (Rol-гены). Образующиеся под их контролем фитогормоны «заставляют» клетки постоянно делиться и «метастазировать» первичные опухоли. Работа других встроенных генов Ti-плазмиды приводит к тому, что клетка опухоли начинает синтезировать несвойственные ей вещества — опины, которые самой клеткой утилизироваться не могут, но служат пищей для бактерий. Таким образом, непрерывное размножение под влиянием принудительного синтеза фитогормонов и синтез опинов делают опухолевые клетки несопоставимыми с каллусными.
Для образования каллусной ткани in vitro клетки экспланта должны пройти процесс дедифференциации, т. е. утратить специфические характеристики исходной ткани.
Перестройка клеток эксплантов разных специализаций, предшествующая каллусогенезу, проходит сходным образом. Клетки эксплантов в первую очередь теряют вещества запаса — липиды, крахмал, белки. Фотосинтезирующие клетки теряют хлорофилл и липиды хлоропластов, но при этом возрастает количество амилопластов, разрушается аппарат Гольджи, перестраиваются эндоплазматический ре- тикулюм и элементы цитоскелета. Клетки синтезируют РНК и ДНК, и начинается экспрессирование генов белка, присущих каллусным клеткам. Синтез белков эксплантов начинается через несколько часов после переноса экспланта в условия in vitro. Однако эта первая стадия связана с механическим повреждением, и синтез белка останавливается. Вероятно, в этой фазе действуют нативные гормоны растения, которые транспортируются, но возможность длительного синтеза для них исключена (Бутенко, 1999).
Добавление к среде экзогенных гормонов приводит к началу каллусогенеза. Примечательно, что экзогенные гормоны ауксин и цитокинин эффективно действуют только в определенной последовательности. Как правило, сначала к среде надо добавить ауксин, а потом цитокинин; это приводит к делению клеток и каллусогенезу. Обратная последовательность не приводит к образованию каллуса.
После индуцирования образования каллуса в асептических условиях, его отделяют и помещают на поверхность питательной среды. В результате этого получают стерильную культуру каллусной ткани. Каллусную ткань можно поддерживать в культуре неограниченно длительное время, периодически разделяя ее на фрагменты и пересаживая на новую среду.
Образование каллуса происходит в области первичных или вторичных меристем, а также из паренхимы, прилегающей к этим меристемам или к вторичным сосудистым тканям. Этот процесс зависит от размера экспланта и составляющих клеток. Многие ткани обладают физиологической полярностью. Очевидно, в связи с этим каллус образуется более интенсивно на стороне экспланта, которая на материнском растении обращена к корню, поэтому при получении каллуса на фрагментах корнеплода моркови экспланты помещают на агар апикальной стороной. В случае изоляции эксплантов из клубней (топинамбур, картофель), полярность не имеет существенного значения. Для полного исключения влияния полярности, экспланты топинамбура можно помещать на поверхность среды тангентально (NitschJ.P., NitschС., 1956).
Источник: Тюкавин Г. Б. Основы биотехнологии моркови: Монография / ВНИИССОК. – М., 2007. – 480 с.