Приготовление питательных сред

Выбор питательной среды

Успех в культивировании культур клеток, тканей и органов растений во многом определяется составом питательной среды. К настоящему времени разработано множество составов питательных сред, большинство из которых является модификациями основных сред, приспособленных к частным случаям культивирования тканей и органов. Состав наиболее широко применяемых питательных сред приведен в монографии Ф.Л. Калинина, В.В. Сарнацкой и В.Е. Полищук (1980).

При разработке новой питательной среды для культивирования, О.Л. Гамборг (Gamborgetal., 1976) рекомендовал использовать в качестве контрольной – среду Мурасиге и Скуга (Murashige, Skoog, 1962), которая широко используется для выращивания каллусных и суспензионных культур, исследования морфогенеза, содержит достаточные количества питательных солей в благоприятных для роста соотношениях.

Примером оптимизации сред для культивирования суспензии моркови является работа японских исследователей (Masudaetal., 1981), которая была посвящена оценке влияния регуляторов роста, сахаров и источников азота на соматический эмбриогенез в суспензионной культуре культурной моркови с целью пересмотра среды, пригодной для быстрого образования эмбриоидов с высокой частотой.

Состав питательной среды

Компоненты среды для культуры тканей растений можно разделить на шесть групп, что обычно отражает порядок приготовления и хранения концентрированных исходных растворов:

1. основные неорганические питательные вещества (макроэлементы);
2. источник железа;
3. микроэлементы;
4. органические добавки;
5. источник углерода;
6. органические добавки (регуляторы роста растений).

Железо содержится в хелатированной форме в комплексе с ЭДТА. Это обеспечивает его доступность при рН до 8,0 в течение всего периода роста культуры, тогда как при отсутствии хелатирующего агента недостаток железа может возникнуть очень быстро.

Для приготовления агаризованных сред добавляют агар в концентрации 6-10 г/л. При работе с культурой пыльников растений важно использовать агар хорошего качества, пригодный для бактериологических исследований. Величину рН среды обычно доводят до 5,5-6,0 перед автоклавированием. Однако в дальнейшем она слегка снижается в результате образования сахарных кислот в процессе автоклавирования.

Приготовление питательных сред

В настоящее время выпускается довольно широкий ассортимент готовых питательных сред (в том числе МС и Б5) в виде сухих порошков, содержащих все необходимые компоненты, за исключением регуляторов роста, сахарозы и агара (фирма Sigma). Готовые среды очень удобны для обычного культивирования. Однако у них есть ряд недостатков: они дороги, и их применение ограничено для исследований, в которых необходимо варьирование компонентов сред.

Приготовление питательных сред происходит из отдельных соединений довольно просто, как, например, среду МS:

1. Готовят исходные растворы макроэлементов, микроэлементов, витаминов и регуляторов роста растений.
2. Для приготовления 1 л жидкой среды в стакан объемом 1 л, стоящий на магнитной мешалке, мерными цилиндрами и/или пипетками переносят необходимый объем каждого из исходных растворов.
3. Добавляют сухие мезоинозит, гидролизат казеина и сахарозу; полностью растворяют их, добавляя при необходимости воду.
4. Дистиллированной водой доводят объем до 950 мл.
5. Доводят рН до 5,6-5,9 с помощью 1М NaOH.
6. Переносят среду в мерный цилиндр или колбу объемом 1 л и доводят объем до метки дистиллированной водой.
7. Переносят среду обратно в колбу и перемешивают на мешалке до полного растворения.
8. Разливают среду порциями в культуральные емкости (пробирки, колбы, и т. д.), закрывают их сверху (ватными пробками, алюминиевой фольгой и т. д.) и автоклавируют в течение 20-30 минут при 120 °С.
9. При приготовлении агаризованной среды на этапе 4 объем жидкой среды доводят до 450 мл, а в 450 мл дистиллированной воды растворяют необходимое количество агара.

Необходимо помнить, что маточные растворы неорганических веществ, хелата железа, витаминов и регуляторов роста следует хранить в холодильнике при 2-4°С. В случае помутнения или инфицирования маточных растворов их следует заменять. Исходные растворы регуляторов роста рекомендуется готовить небольшими объемами. Все растворы должны быть приготовлены из реактивов марки не ниже ХЧ на бидистилляте. При использовании солей в форме кристаллогидратов необходимо делать соответствующие перерасчеты с учетом количества молекул Н₂0.

Источник: Тюкавин Г. Б. Основы биотехнологии моркови: Монография / ВНИИССОК. – М., 2007. – 480 с.

Автор фото в статье: Ляпустина Е.В.