Растущая потребность в пробиотических препаратах и продуктах питания обусловливает необходимость разработки новых эффективных и недорогих производственных питательных сред для накопления биомассы бифидобактерий. Производственные питательные среды должны обеспечивать высокую скорость размножения бактерий вместе с минимальной длительностью их ростового цикла для получения высокой концентрации жизнеспособных микробных клеток в единице объема питательной среды (не менее 108 КОЕ / мл). Сырье для приготовления таких сред должна быть доступной, недорогой, технологически целесообразной.
Бифидобактерии при первичном выделении являются строгими анаэробами. В присутствии углекислого газа они могут быть толерантными к кислороду. При лабораторном культивировании эти микроорганизмы приобретают способность развиваться в присутствии некоторого количества кислорода, а в высокопитательных средах — расти в условиях полностью аэробных. Чувствительность к кислороду у многих штаммов бифидобактерий варьирует, что обусловлено различиями в механизме брожения.
Размножение бифидобактерий обусловлено огромным количеством факторов роста. Многие виды требуют биотин, пантотеновая кислота, цистеин, рибофлавин, пуриновые и пиримидиновые основания, пептиды, аминосахара, кофермент А, олигосахариды, некоторые ненасыщенные жирные кислоты и др.. Отдельные штаммы требуют углекислого газа, аммиака, гистидина. Из аминокислот требуется лизин, пролин, серин, аланин, аспарагинова и глутаминовая кислоты.
В синтетических средах бифидобактериям для роста необходимы железо, магний, фосфаты, хлориды калия и натрия, в некоторых случаях — марганец.
Бифидобактерии культивируют, создавая анаэробные условия или понижая окислительно-восстановительный потенциал среды, на молоке, гидролизованном молоке и гидролизат казеина, а также на печеночном бульоне с добавлением ростовых веществ (дрожжевого автолизат, кукурузного экстракта, цистеина и др.). На плотных питательных средах бифидобактерии образуют разнообразные колонии плоские, полушаровидные, блестящие, жесткие, окруженные валом, имеют более темный центр и т.д. Цвет колоний меняется от белого и серого до темно-коричневого. Колонии часто напоминают формой зерно гречки или усеченную треугольную пирамиду, на некоторых средах колонии имеют форму чечевицы.
В настоящее время для накопления биомассы Bifidobacterium longum используют питательные среды различного состава. Основой служат гидролизаты и экстракты растительного и животного происхождения: среда Блаурока на основе печеночного отвара, кукурузно-лактазная среду на основе кукурузного экстракта, среды на основе полученного мясного экстракта.
Для культивирования бифидобактерий распространенным считается печеночно-цистеиновых среда (среда Блаурока).
Для приготовления среда Блаурока 500 г говяжьей печени, освобожденной от сухожилий, пропускают через мясорубку, заливают двойным количеством воды и кипятят в течение 2 ч, затем фильтруют. Фильтрат доводят дистиллированной водой до 1 000 см и вносят 10 г пептона, 10 г лактозы, 100 мг хлористого цистеина, 5 г NаС1 и агара 1-2 г. рН среды 6,8-7,0. Однако это среда дорогое, содержит дефицитные компоненты, поэтому мало пригодно для использования в промышленных условиях.
В молочной промышленности для культивирования бифидобактерий рекомендовано гидролизатно-молочная среда — ГМ-среду, содержащую гидролизат обрату, NaCl, лактозу, L-цистеин солянокислый, пептон, агар-агар и воду. Гидролизатно-молочное питательную среду готовят следующим образом:
Приготовление гидролизованного молока. Обычное или восстановленное обезжиренное молоко (молочный обрат) доводят до кипения и кипятят 2 мин, охлаждают до 14oC, устанавливают pH 7,9 10-20% раствором NaOH.
Добавляют панкреатин из расчета 1 г/дм3, предварительно разведенный в небольшом количестве нагретой до 44oC воды, размешивают и ставят в термостат на 40oС в ватной пробкой. В течение первых двух часов перемешивания и коррекцию pH до 7,9 проводят каждые 30 мин, в следующие два часа через каждый час. Через 4 ч от начала гидролиза добавляют 1-2% хлороформа, закрывают резиновой пробкой и ставят в термостат. Через 4 часа доводят pH до 4,4 30% раствором уксусной кислоты, кипятят, помешивая, не менее 15 мин, фильтруют через бумажный фильтр. Готовый гидролизат должен содержать 200-300 мг /% аминного азота, прозрачный, реакция его нейтральная или слабокислая.
Приготовление гидролизатно-молочной среды. Разводят гидролизованные молоко питьевой водой в соотношении 1:1. В небольшом количестве разбавленного гидролизата расплавляют агар в количестве 2,5 г на 1 дм3 среды. К остальным количества гидролизата добавляют 28 г пептона и 3,5 г хлористого натрия, смесь нагревают до температуры 80oC, после чего смешивают с расплавленным агаром. В смеси устанавливают pH 7,5, кипятят в течение 15 мин, дают отстояться, сливают с осадка, не фильтруя, доливают горячей дистиллированной водой до заданного объема и добавляют в нее 10,0 г лактозы и 0,15 г солянокислого цистеина. Среда заливают в пробирки высоким столбиком 10 см3 и стерилизуют при температуре 112oC в течение 30 мин с предварительным подогревом автоклава паром в течение 30 мин. pH готового среды 7,1-7,3.
Гидролизатно-молочная среда широко используется в Украине и других странах СНГ для наращивания биомассы бифидобактерий. Эта среда обеспечивает получение бифидобактерий в концентрации 108-109 КОЕ / мл. Оно достаточно простое в изготовлении. Вместе с тем, ГМС имеет ряд недостатков. Основной из них — медленный рост бифидобактерий. Так, при выращивании на этой среде бифидобактерии достигают максимума концентрации после 18-24 ч культивирования.
Для выделения и выращивания Enterococcus faecium существует ряд селективных сред: основа кровяного агара с азидом, азидодекстрозний бульон, KF-стрептококковый агар, М-агар для энтерококков, стрептококковый селективный агар и др. На кровяном агаре колонии энтерококков мелкие, кремовые или белые, гладкие с ровным краем, различающихся по типу гемолиза. Данный штамм — гомоферментативных, газа не образует конечный продукт ферментации глюкозы и других углеводов — молочная кислота. В энтерококков резко выраженные редуцируя свойства: они обесцвечивают лакмус и метиленовый синий в молоке, редуцируют нитраты в нитриты.
Для культивирования Enterococcus faecium используют азидно-глюкозный бульон. Питательная среда предназначена для выделения и культивирования энтерококков, выделенных из исследуемого материала. Среда является селективным и обеспечивает преимущественный рост энтерококков. Азидно-глюкозный бульон готовят следующим образом: Приготовление МПБ. 500 г мелко нарезанного свежего мяса без костей, жира и сухожилий заливают в эмалированной кастрюле 1 л водопроводной воды, нагретой до 50°С, и оставляют настаиваться 12 ч при комнатной температуре или 1 ч при 50-55°С. Мясо отжимают, экстракт процеживают через марлю со слоем ваты, кипятят в течение 30 мин для свертывания коллоидных белков и фильтруют дважды (первый раз через марлю с ватой, второй — через бумажный фильтр). Фильтр доливают водой до 1 л, разливают в колбы, закрывают ватными пробками и стерилизуют при 120°С 20 мин (пробки колб закрывают сверху колпачками из бумаги). Ватные пробки должны быть плотными, поскольку они являются фильтром, препятствующим проникновению бактерий из воздуха после стерилизации. Мясной бульон может быть использован в любое время для приготовления соответствующих сред. Если их готовят сразу, то предварительная стерилизация излишня. Если желательно иметь мясной бульон особо высокой питательности, во время настаивания мяса с водой добавляют немного пепсина и подкисляют бульон соляной кислотой. Пепсин дополнительно гидролизует белковые соединения мяса, и количество усвоенных бактериями питательных веществ возрастает. Мясо можно заменить мясным экстрактом, беря его по 5 г на 1 л среды.
Для приготовления МПБ до 1 л мясного бульона добавляют 5-10 г пептона (пептон — первый продукт гидролиза белка с высокой молекулярной массой) для повышения калорийности среды и 5 г поваренной соли с целью создания осмотической активности. Среда нагревают до растворения пептона, постоянно помешивая. Затем устанавливают нейтральную или слабощелочную реакцию среды, подливая 20% раствор Na2CO3 (до посинения влажной красной лакмусовой бумажки, при этом фенолфталеин еще не показывает щелочную реакцию — при добавлении его к среде в фарфоровой чашке розовая окраска не появляется). Удобно использовать индикатор бромтимолблау. 1-2 капли его вносят стеклянной палочкой в фарфоровую чашку и добавляют каплю бульона. В нейтральной среде бромтимолблау темно-зеленый, в кислой — желтый, в щелочной — синий. После установки реакции среду снова кипятят 5-10 мин и белки свернулись от изменения реакции, фильтруют через бумажный фильтр без осветления бульона или осветлив его белком. Прозрачный МПБ разливают в пробирки, закрывают ватными пробками и стерилизуют при 120°С в течение 20 мин.
Приготовление азидно-глюкозного бульона. До 1 дм3 МПБ добавляют 5,0 г пептона, 7,5 г глюкозы, 2,5 г натрия хлорида, составляющие растворяют нагреванием. После этого охлаждают и устанавливают рН так, чтобы после стерилизации при 25°С он составлял (7,2 ± 0,1). Затем основу среды стерилизуют текучим паром (при 100°С) в течение 30 мин. В основу среды, охлажденного до 50°С, добавляют 2,0 см3 натрия азид, и 2,0 см3 раствора бромкрезолового пурпурного. Готовая среда не стерилизуют. Среда хранят в защищенном от света и высыхания месте при (4 ± 2)° С не более 3 мес. Непосредственно перед использованием ее разливают по 5 см3 в стерильные пробирки.
Так, бифидобактерии и энтерококки, наряду с другими представителями нормальной кишечной микрофлоры, выполняют и регулируют многочисленные функции организма. В процессе жизнедеятельности они образуют органические кислоты, что приводит к установлению нормальной среды для кишечника, препятствуют размножению патогенной, гнилостной и газообразующей микрофлоры кишечника. Способствуют процессам ферментативного переваривания пищи, так как усиливают гидролиз белков, сбраживают углеводы, омилюють жиры, растворяют клетчатку, стимулируют перистальтику кишечника, способствуют нормальной эвакуации кишечного содержимого.
Bifidobacterium longum ATCC 15707 в промышленности культивируют, создавая анаэробные условия или понижая окислительно-восстановительный потенциал среды, на гидролизованном молоке. Для культивирования Enterococcus faecium SF68 используют азидно-глюкозный бульон. Питательная среда предназначена для выделения и культивирования энтерококков, выделенных из исследуемого материала. Среда является селективным и обеспечивает преимущественный рост энтерококков.
Автор стаnьи: Билецкая Д. Материал статьи любезно предоставила Просяник Алина, студентка кафедры биотехнологии и микробиологии Национального университета пищевых технологий.