Основой питательной среды для изготовления вакцины от рожи является бульон Хоттингера с триптическим переваром говяжьего сырого фарша из мяса животных средней упитанности, или мясная вода из говяжьего мяса от животных средней упитанности.
Приготовление бульона Хоттингера
На 1 кг говяжьего сырого фарша добавляют 1,5 л дистиллированной (обессоленной) воды с t=40-42°С и 7-8 г натрия двууглекислого из расчета, чтобы рН=7,2-7,4. После этого на каждый килограмм фарша додають150-200г измельченной поджелудочной железы или 20-25 г панкреатина и на каждый литр смеси 10 см3 хлороформа. Все выше перечисленные компоненты в соответствующей последовательности закладывают в реактор, плотно закрывают люк и тщательно перемешивают. Смесь должна заполнять не более 3/4 емкости реактора, ее температура поддерживается в пределах 40-42°С. В первые 12 часов после загрузки содержимого реактора перемешивают каждые 2 часа, в дальнейшем 2-3 раза в сутки. В процессе гидролиза ежедневно определяют рН, который поддерживают в пределах 7,2-7,4 добавлением 10%-го раствора натрия гидроксида. Полное ферментативное расщепление фарша проходит за 5-6 дней, при этом он превращается в смесь с сероватым рыхлым осадком и над осадочной жидкостью светло соломенного цвета, рН стабилизируется на уровне 6,8-6,9. Химические показатели качественного перевара должны быть: общий азот 1000-1400мг%, аминный азот 750-1000мг%, триптофан 200-300мг%, рН 6,8-6,9. при необходимости хранения триптичного перевара Хоттингера течение 2-3 месяцев его прогревают при температуре 80°С в течение 20-30 минут, охлаждают до 25-30°С и добавляют хлороформ в количестве 10 см3 на 1 литр перевара, хранят в темном прохладном месте.
Приготовление мясной воды для питательной среды – бульон Хоттингера
Мясную воду готовят из расчета на одну часть фарша – 4 части воды (дистиллированной или водопроводной обессоленной), настаивают 1 час. Затем доводят до кипения и кипятят 1 час, после чего фарш отжимают, а жидкость используют для приготовления питательной среды.
Изготовление питательной среды бульона Хоттингера
Для изготовления питательной среды используют основной перевар Хоттингера или мясную воду из фарша говядины. Если питательная среда изготавливают из ОПХ, то перевар с осадком разбавляют дистиллированной или обессоленной водой до содержания аминного азота 90-110 мг%, к смеси добавляют 100-120 г соляной кислоты на 100 л среды, кипятят и без предварительного отстаивания фильтруют через ватно-марлевый фильтр. Фильтрат сливают в варочную емкость для дальнейшего приготовления питательной среды.
Фильтрат с ОПХ или мясную воду сливают в варочную емкость, доводят до кипения, добавляют 0,3% хлористого натрия и 0,5% пептона. Во время кипения, при перемешивании добавляют 0,15% агар-агара, предварительно растопленного в мясной воде в автоклаве, затем добавляют 1% желатина, промытого спиртом. После растопки желатина в кипящую питательную среду прибавляют 0,5% фосфорнокислого двузамещенного натрия. Кипячение заканчивают и добавляют дистиллированной воды до первоначального объема и 10% на испарение, подщелачивают 4%-м раствором гидроксида натрия или насыщенным раствором натрия углекислого до рН = 7,7-7,8 и кипятят еще 1 час; за 5 минут до конца варки добавляют 0,3% сахарозы. Питательную среду отстаивают в варочном котле 40-60 минут, фильтруют через ватный фильтр и перекачивают в реактор для последующего изготовления вакцины. Реактор предварительно моют и стерилизуют при температуре 120-125°С в течение 2 часов. Количество питательной среды не должна превышать ½ его емкости.
Питательная среда в реакторе стерилизуют 40-60 минут при t = 116-118°С, периодически перемешивая мешалкой. После стерилизации питательную среду охлаждают до t = 35-36°С, периодически перемешивая и пропуская через внешнюю оболочку реактора холодную воду. При охлаждении в реакторе поддерживается избыточное давление на уровне 0,5-0,6 атм. Готовая питательная среда должна быть прозрачной или слегка опалесцирующей, желтоватого цвета, без осадка, иметь рН = 7,4-7,6.
Изготовление фосфатно-буферного раствора гидрата окиси алюминия
Заводскую 6%-ую взвесь гидрата окиси алюминия разбавляют до 4%-й, добавляя дистиллированную или обессоленная воду пользуясь формулой Х = 100х А / В, где Х,см3 – количество исходного («В» – процентной) смеси, в которую необходимо добавить воду до 100 см3, чтобы получить «А» – процентную смесь. Для получения гидрата окиси алюминия в фосфатном буфере с рН = 7,6-8,1 до 4% взвеси гидроокиси алюминия добавляют натрий фосфорнокислый двузамещенный (Na2HPO4х 2H2O) и калий фосфорнокислый однозамещенный из расчета на 1 литр гидроокиси алюминия согласно таблице:
| рН 4% взвеси гидроокиси алюминия | Количество вещества на 1л 4% взвеси гидроокиси алюминия | рН 4% взвеси гидроокиси алюминия с буфером | ||
|---|---|---|---|---|
| Количество 4% взвеси, см3 | Na2HPO4, г | КН2РО4, г | ||
| 6,9-7,9 | 1000 | 11,425 | 0,246 | 8,1 |
| 1000 | 10,816 | 0,290 | 8,0 | |
| 1000 | 10,533 | 0,560 | 7,9 | |
| 1000 | 9,820 | 0,907 | 7,7 | |
4% взвесь гидроокиси алюминия, смешанная с натрием фосфорнокислым и калием фосфорнокислым, кипятится в варочном котле 40-60 минут, после чего фильтруется через шелковое полотно (сито), перекачивается в реактор и стерилизуется при 2 атм. и 132°С в течение 2-2,5 часов, после стерилизации охлаждается до температуры 36-37°С.
Автор статьи: ст. каф. Биотехнология и БЖД, УГХТУ Мельников М.