Эргостерин – исходный продукт производства жирорастворимого витамина D2 и кормовых препаратов, обогащенных витамином D2. В группу витаминов Dобъединяют родственные соединения, важнейшими из которых являются витамины D2 и D3, обладающие антирахитичным действием. Витамин D2 (эргокальциферол) образуется при облучении ультрафиолетовым излучением эргостерина, витамин D3 (холекальциферол) образуется из 7-дегидрохолестерина. В организме человека и животных эти соединения регулируют усвоение кальция и фосфора из пищи и отложение их в костной ткани. В основе структуры эргостерина и витамина D лежит четыре углеродных цикла (А, В, С, D). В случае витамина D кольцо В разомкнуто.
Продуценты эргостерина
Источником эргостерина являются фитопланктон, бурые и зеленые водоросли, но особенно богаты эргостерином дрожжи и плесневые грибы, которые и служат сырьем для его промышленного получения [1,4,5]. В отношении эргостерол синтезирующей способности (% эргостерола в абсолютно сухих дрожжах) дрожжи при поверхностном культивировании располагаются в следующем порядке: Saccharomyces. carlsbergensis (0,49-4,3), S. ellipsoidetis (1,2-1,5), Rhodotorula glutinis (0,7-0,9), Candidautilis (0,4-0,6), С. tropicalis ( 0,2-0,3). В мицелии грибов Aspergillus и Penicillium содержание стеринов может достигать 1,2-1,4%; (Р. westlingii около 2,2%) в расчете на сухой мицелий [1,5]. Бактерии, как правило, синтезируют ничтожные количества стеринов. Обычно содержание стеринов в их клетках составляет 0,001-0,1 мг/г сухой биомассы. Стерины обнаружены у Lactobacillus arabinosus, L. pentosus, Escherichia coli, Azotobacter chroococcum, Micromonosporasp., Streptomyces griseus, Sphaerotillis natans, Rhodospirillum rubrum.
Биосинтез эргостерина
Стерины относятся к терпенам и имеют путь биосинтеза, подчиняющийся «изопреновому правилу». В соответствии с этим правилом, стерины (тритерпены) синтезируются из изопреновых единиц в результате прохождения четырех стадий: 1) образование мевалоната из ацетил-КоА или лейцина; 2) дегидратирование и декарбоксилирование мевалонилпирофосфата с образованием «активного изопрена» – изопентенилпирофосфата и конденсация изопреновых звеньев с образованием ациклических терпенов разной длины; 3) циклизация ациклических структур; 4) дальнейшая модификация циклической структуры. Интермедиатами синтеза стеринов являются ацетат, мевалоновая кислота, сквален, ланостерин. Сквален – общий предшественник стеринов растительного и животного происхождения, накапливается в дрожжах и при аэрации превращается в стерин. Расхождение путей происходит на уровнефарнезилпирофосфата:
В случае стеринов он димеризуется с образованием сквалена.
При циклизации и отщеплении протона образуется ланостерин, предшественник холестерина и эргостерина:
Условия образования эргостерина дрожжами. Наиболее высокие количества стеринов синтезируют штаммы Saccharomyces carlsbergensis ИНМИ-101 и Sacch. carlsbergensis. Биомасса Sacch. carlsbergensis может содержать более 10% эргостерина. Важное условие синтеза эргостерина дрожжами – хорошая аэрация. В анаэробных условиях в клетках дрожжей накапливается предшественник эргостерина – сквален. Показано, что кислород индуцирует синтез стеринов, оказывая активирующее влияние на эпоксидазу сквалена – первого фермента биосинтетического пути. Индукция синтеза эргостерина начинается при 0,03%-ом содержании О2 в газовой фазе и достигает максимума при 2%-ой концентрации.
Для биосинтеза стеринов дрожжами важно, чтобы среда содержала большой избыток углеводов и мало азота. Дрожжи, богатые белком, как правило, содержат мало стеринов. Эти данные касаются главным образом пекарских дрожжей. В случае дрожжей рода Candidaвысокое C/Nв среде приводит к накоплению липидов, а не эргостерина. Для дрожжей, использующих н-алканы, последние являются лучшим источником углерода для синтеза эргостерина, чем углеводы. Стимулирующее действие на образование стеринов дрожжами оказывают ингибиторы гликолиза и разобщители окислительного фосфорилирования и дыхания, а также обеспеченность дрожжей витаминами, и прежде всего пантотеновой кислотой, которая в составе КоА участвует в построении молекулы эргостерина. При действии на дрожжи рентгеновского излучения содержание эргостерина увеличивается в 2-3 раза, что объясняют угнетением процесса аминирования, сопровождающегося повышением синтеза липидов. Синтез стеринов не связан с ростом дрожжей. Содержание стеринов повышается по мере старения культуры и стеринообразование продолжается после остановки роста дрожжей.
Получение и применение эргостерина
В промышленности эргостерин получают, используя дрожжи Sacch. cerevisiae, Sacch. carlsbergensis, атакже мицелиальные грибы [1,5]. Засев производят большим количеством инокулята. Культивирование ведут при высокой температуре и сильной аэрации в среде, содержащей большой избыток источников углерода по отношению к источникам азота.
На выход витамина D2 (и образование других соединений) оказывают влияние длительность облучения, температура, наличие примесей. Поэтому облучение эргостерина, используемого в качестве пищевых добавок, производят с большой осторожностью.
Для получения кристаллического витамина D2дрожжи или мицелий грибов подвергают гидролизу раствором соляной кислоты при 110°С. Гидролизованную массу обрабатывают спиртом при 75-78°С и после охлаждения до 10-15°С фильтруют. Фильтрат упаривают до содержания в нем 50% сухих веществ и используют как концентрат витаминов группы В. Витамин D2получают из массы, оставшейся после фильтрации. Массу промывают, сушат, размельчают и дважды обрабатывают при 78°С трехкратным объемом спирта. Спиртовые экстракты сгущают до 70%-ого содержания сухих веществ. Таким образом получают липидный концентрат. Его омыляют раствором NaOH, а стерины остаются в неомыленной фракции. Кристаллы эргостерина выпадают из раствора при 0°С. Очистку кристаллов проводят путем перекристаллизации, последовательным промыванием 69%-ым спиртом, смесью спирта и бензола (80:20) и повторной перекристаллизацией. Полученные кристаллы эргостерина сушат, растворяют в эфире, облучают, после чего эфир отгоняют, а раствор витамина концентрируют и кристаллизуют. Для получения масляного концентрата раствор витамина после фильтрации разбавляют маслом до стандартного уровня [1]. Обогащенные эргостерином, облученные ультрафиолетовым излучением дрожжи используют в животноводстве как кормовую добавку. Эргостерин – исходный продукт для получения некоторых стероидных гормонов, лечебных и пищевых препаратов. Количество производимого пока эргостерина недостаточно для нужд народного хозяйства и внедрение новых производственных мощностей – задача ближайшего будущего.
Список литературы
1. Промышленная микробиология: Учеб. пособие для вузов П 81 по спец. “Микробиология” и “Биология” / З.А.Аркадьева, А.М. Безбородов, И.Н.Блохина и ДР.; Под ред.. Н.С. Егорова. – М.:Высш. шк., 1989. – 688 с.: ил.
2. Н.А. Шмалько, И.И. Уварова, Ю.Ф. Осляков. Амарантовая мука – антиоксидантная добавка для макаронных изделий, обогащенных β–каротином // Пищевая технология. – 2004г. – №5–6. – стр. 39–41.
3. К.К. Полянский, Л.В. Голубева, О.И. Дол матова, Д.В. Дорохина. Изучение реологических свойств видов молочных консервов с β–каротином // Пищевая технология. – 2001г. – №1. – стр. 28–29.
4. Никтин Г.А. Биохимические основы микробиологических производств: : Учеб. пособие. – Киев: Вища школа. Головное изд-во, 1981. – 312 с.
5. Елинов Н.П. Основы биотехнологии. Издательская фирма “Наука” СПБ 1995г. 600 стр. 166 ил.
6. Голубев В.Н., Жиганов И.Н. Пищевая биотехнология. – М.: ДеЛи принт, 2001. – 123 с.