Морфометрические кореляции развития элементов зерновки в период раннего эмбриогенеза у кукурузы
В последнее время обострился интерес к изучению механизмов половой репродукции у цветковых растений на качественно новом уровне [1-5]. Совершенствование техники изоляции мужских и женских гамет, их слияние, эндоспермиогенез и эмбриогенез in vitro из полученных в результате искусственного оплодотворения зигот открывают широкие перспективы для изучения механизма двойного оплодотворения, оценки экспрессии трансгенов в зависимости от типа гамет, познания гаметного детерминизма и барьеров несовместимости в постгамной фазе оплодотворения, особенностей интеграции цитоплазмы спермия в цитоплазму яйцеклетки, физиологии сингамии и тройного слияния [1-4].
Собственно процесс оплодотворения и особенно ранние этапы развития зародыша и эндосперма проходят при глубоком погружении в ткани материнского организма – нуцеллуса и интегументов, которые после оплодотворения формируют соответственно перисперм (у некоторых видов) и семенную оболочку. Искусственное же оплодотворение in vitro подразумевает изоляцию гамет и их принудительное слияние. Данная техника состоит из нескольких этапов, которые вместе позволяют эффективно осуществлять этот сложный природный процесс. Этими этапами являются изолирование зародышевых мешков и яйцеклеток, изолирование спермиев, слияние гамет in vitro, культивирование зигот и зиготусодержащих зародышевых мешков, культура молодых зиготических зародышей и эндосперма.
В настоящее время технологии изоляции репродуктивных структур кукурузы разработаны недостаточно, отсутствуют данные относительно корреляции динамики развития зерновок, зародышевых мешков, зародышей и эндосперма у разных генотипов. Отсутствие четких, надежных методик изоляции репродуктивных структур кукурузы на необходимой стадии обусловливает несовершенство процесса слияния в искусственных условиях яйцеклеток со спермиями и развития проэмбрио in vitro.
В связи с актуальностью техники изоляции репродуктивных структур, неразработанностью вопросов в области технологии искусственного оплодотворения и эмбриогенеза на первом этапе целью нашей работы было установление морфометрических корреляций развития элементов зерновки в период раннего эмбриогенеза у кукурузы для дальнейшего совершенствования методики изоляции зародышевых мешков и молодых зародышей кукурузы . Оптимизация техники изолирования именно этих структур не только готовит базу для разработки техники искусственного оплодотворения, но и обеспечивает возможность культивирования изолированных незрелых зародышей начиная с первых этапов развития.
Для достижения цели были поставлены задачи провести морфометрические исследования зародышевых мешков, зерновок и початков в период с первых по десятые сутки после опыления, установить коэффициенты парной корреляции между морфометрическими показателями, характеризующих зародышевый мешок, зерновку и початок после опыления, рассчитать уравнение регрессии между морфометрическими показателями.
Материалом для исследования служили зерновки гибрида кукурузы And44 × B14.Донорные растения выращивали в поле согласно методике полевых исследований. С первых по десятые сутки после опыления початок удаляли с растения, в день удаления проводили фиксацию початков в 70º спирте. Для изоляции зародышевых мешков использовали механическое выделение. Морфометрические наблюдение вели на временных препаратах под микроскопами МБС-1 и «МИКМЕД-5». Зародышевые мешки окрашивали сафранином, Лихт-грюном и альциановым синим. Статистическая обработка результатов выполнена по Г.Ф. Лакин (1990).
В исследованиях морфометрических корреляций были включены початки кукурузы примерно 3-10-х суток после опыления. Этот период соответствует раннему эмбриогенезу, когда происходит формирование органов зародыша. После 10 суток зародыш имеет все необходимые органы и может прорастать.
Корреляции развития зерновки и зародышевого мешка изучали на початках диаметром больше 16 мм, поскольку выделение зародышевых мешков с початков меньших размеров затруднено.
Для установления взаимосвязей между диаметром початка, длиной зерновки и длиной зародышевого мешка в период раннего эмбриогенеза проводили морфометрические наблюдения, результаты которых представлены в таблице 1.
Диаметр початков, взятых для исследования, колебался от 12 до 34 мм, длина зерновки — от 3,00 до 7,17 мм, ширина зерновки — от 2,50 до 7,18 мм. Длина зародышевого мешка в зерновках початков диаметром от 16 мм варьировала от 0,30 до 1,56 мм.
Как видно из таблицы 1, с ростом диаметра початка увеличиваются размеры зерновок и зародышевых мешков. С початков диаметром менее 16 мм зародышевый мешок выделить не могли. Начиная с 4-х суток после опыления зародышевый мешок теряет адгезию с клеточными оболочками нуцеллуса и его уже можно выделить с помощью тонких игл. Особенно легко удаляется зародышевый мешок, в котором уже прошло оплодотворения и происходит разделение в клетках зародыша и эндосперма.
Морфометрические наблюдения за коррелированным ростом зародышевого мешке, зерновки и початка позволили охарактеризовать зависимость между размерами этих структур и стадиями развития. Снабжения питательными веществами зерновки приводит к пропорциональному увеличению всех ее элементов, при этом, зависимость между длиной зародышевого мешка и диаметром початка становится линейной, о чем свидетельствует высокий коэффициент корреляции.
Анализ данных, представленных в таблице 1, показал, что между основными морфометрическими показателями существуют положительные, существенные на уровне значимости 0,05, тесные корреляции. Так, между диаметром початка и длиной зародышевого мешка коэффициент корреляции составляет 0,97, между длиной зерновки и длиной зародышевого мешка 0,73, а между шириной зерновки и длиной зародышевого мешка 0,77. Анализ коррелятивных взаимосвязей роста и развития элементов зерновки в период раннего эмбриогенеза позволил составить уравнения регрессии. Все зависимости являются линейными.
Рассчитаны уравнения регрессии могут быть использованы при определении длины зародышевого мешка по размерам початка и зерновки, без изоляции зародышевых мешков. Это позволит определять состояние развития зародышевого мешка и зародыша непосредственно на растении и отбирать для изоляции яйцеклеток, зигот и зародышей на ранних стадиях развития.
Таким образом, в ходе работы были проведены морфометрические исследования зародышевых мешков, зерновок и початков, в период 10 суток после опыления и установлено, что между морфометрическими показателями зерновки существует положительная, тесная, существенная корреляция. Рассчитаны коэффициенты парной корреляции и уравнения регрессии между морфометрическими показателями, характеризующих зародышевый мешок, зерновку и початок. Полученные данные имеют практическую ценность, поскольку позволяют выбирать початки и зерновки определенного размера в полевых условиях с целью последующего изоляции из них зародышевого мешка и зародыша необходимой стадии развития.
Список литературы
- Сатарова Т.Н. Искусственное оплодотворение у кукурузы и перспективы его использования // Вісник Дніпропетровського університету. Сер. Біологія. Екологія. – 2006. – №4. – С.172 – 176.
- Gutiérrez-MarcosJ.F., DickinsonH.G.,LörzH., KranzE. et al.Construction and screening of subtractedcDNA libraries from limited populations of plant cells: a comparative analysis of gene expression between maize egg cells and central cells // The Plant Journal. – 2005. – №44. – P.167-178.
- Kranz E., Hoshino Y., Okamoto T., Scholten S.Double fertilization in vitro and transgene technology // Plant Biotechnology and Molecular Markers. – Netherlands: Springer, 2006. – P.31-32.
- Okamoto T., Scholten S., Loerz H., Kran zE. Identification of genes thatare up- or down-regulate din the apical or basal cell of maize two-cell edembryos and monitoring the irexpression during zygote development by а cell manipulationan dPCR-based approach // Plant and Cell Physiology. — 2005. — Vol.46. — P.332 — 338.
- Wang Y.Y., Kuang A., Russell S.D., Tian H.Q.In vitro fertilization as a tool for investigation sexual reproduction of angiosperms // Sex. Plant Rep. – 2006. – V.19. – №3. – P.103-115.
Робота виконана за підтримки Державного фонду фундаментальних досліджень, грант № Ф25/581 – 2007.
Источник: Ляпустіна О. В. Морфометричні кореляції розвитку елементів зернівки кукурудзи в період раннього ембріогенезу / О. В. Ляпустіна, Н. В. Заколесник, О. В. Українець // Бюлетень інституту зернового господарства (Науково методичний центр з проблем зернового господарства). – 2008. – №№ 33-34. – С. 149-152.
Автор фото в статье: Ляпустина Е.В.