Химические факторы культивирования, а именно состав питательной среды (органический, минеральный, типы и концентрации используемых регуляторов роста, pH среды культивирования).
Углеводное питание. Образование вторичных соединений часто зависит от состава базовой питательной среды. Наиболее эффективным источником углерода для культур тканей обычно служит сахароза или глюкоза, используемая, в концентрациях 2-3 % [170]. Возможность культивируемых клеток метаболизировать другие углеводы подтверждена многочисленными исследованиями, однако, наиболее эффективными являются все же сахароза и глюкоза. Известно, что при использовании в качестве источника углерода глюкозы рост культур замедляется, а накопление вторичных метаболитов отмечено лишь в единичных случаях. При использовании 2-3 % раствора сахарозы происходит нормальное накопление метаболитов и рост культуры [21, 107, 167, 170, 188]. В некоторых случаях повышение концентрации сахарозы до 7-10 % вызывает положительный эффект в накоплении метаболитов. Так, использование 7 % раствора сахарозы приводило к увеличению накопления розмариновой кислоты в культуре Coleus blumei Benth., а также накоплению нафтохинонов в культуре клеток Lithospermum erytrorhizon [223, 235]. При выращивании продуцентов сапонинов Glycyrrhyza uralensis Fisch. ex DC., Panax quinquefolius L., P. ginseng C. A. Mey. и других видов рода Panax используют концентрации сахарозы, равные 3-5 % [123, 144, 160, 169, 171, 249]. В литературе имеются данные, что при низких концентрациях углеводов активно накапливаются метаболиты в культуре клеток табака [59, 107].
Минеральное питание. Минеральный состав сред оказывает большое влияние на синтез вторичных соединений. При этом наиболее важное значение имеет содержание фосфора, калия и различных форм азота. Высокие концентрации фосфора в большинстве случаев приводят к улучшению роста культуры и ухудшению синтеза вторичных метаболитов. Их синтез начинается обычно после истощения фосфора в питательной среде. Высокие концентрации фосфора в среде снижают синтез никотина в культуре клеток табака, антоцианов в культивируемых клетках моркови, фенолов в клетках чая [59, 107, 115, 167]. Ранние исследования вторичного метаболизма показывают, что увеличение содержания в средах органических форм азота за счет пептона или дрожжевого экстракта повышало выход вторичных метаболитов в культуре клеток и тканей Catharanthus roseus [200, 245, 246]. Однако более поздние исследования продемонстрировали, что как для роста, так и для синтеза вторичных метаболитов культивируемым клеткам необходимы минеральные формы азота. Органические формы – пептон, дрожжевой экстракт и другие тормозят рост ткани и синтез вторичных метаболитов, что показано на примере культуры Dioscorea cauccasica Lipsky. [195]. Очень важным оказалось соотношение аммонийного и нитратного азота: повышение доли нитратного азота способствовало увеличению синтеза метаболитов, в частности, диосгенина в культуре диоскореи [21, 115]. Содержание бетацианина в суспензионной культуре Beta vulgaris возрастало при снижении общей концентрации азота и изменении соотношения аммонийного к нитратному 1:14 [185].
Регуляторы роста (фитогормоны). Эти компоненты среды привлекают наибольшее внимание исследователей. Однако влияние регуляторов роста на синтез вторичных соединений в культуре неоднозначно и может изменяться в зависимости от класса вторичных соединений, физиологического состояния культуры, условий культивирования и других параметров. Наиболее изученными на данный момент являются ауксины и цитокинины, так как именно они являются чаще всего необходимыми компонентами питательных сред, обеспечивающими нормальный рост клеточных культур [4, 20, 23, 33, 35, 36, 49, 59, 60, 64, 73, 85, 86, 89, 90, 98, 107-109, 115, 121, 143, 147, 150, 166-168, 170].
- Ауксины. Наряду со способностью поддерживать рост культур и деления клеток ауксины оказывают различное воздействие на синтез вторичных метаболитов. В некоторых случаях они стимулируют синтез вторичных метаболитов, а других – ингибируют его. Прослеживается так же зависимость между типом ауксина и его способностью стимулировать синтез вторичных метаболитов [45, 111, 158, 159, 169]. Ауксины способствовали синтезу антоцианов в культурах клеток моркови, тополя и винограда, антрахинонов у Cassia fistula L. и Cassia tora L., сапогенинов в Trigonella sp. Они же снижали содержание антрахинонов и шиконина у Lithospermum erithororhizon, скополамина у Hyosciamus niger L., хлорогеновой кислоты у N. tabacum [27, 40, 115, 167]. Синтез никотина в культуре тканей N. tabacum и антоцианов в каллусе винограда стимулируется за счет ИУК и НУК, но тормозится 2,4-Д [35, 40]; синтез нафтохинонов и антоцианов в культуре Plumbago zeylanica L. индуцируется повышением концентрации 2,4-Д, и замедляется в результате добавления ИУК и НУК [59]. В суспензионных культурах Papaver bracteatum ИУК стимулирует синтез алкалоидов типа тебаина более эффективно, чем НУК или 2,4-Д, [87, 88, 107]. В то же время добавление в питательную среду НУК в культурах Plumbagozeylanicaи Lithospermumerythrorhizonполностью останавливает синтез антоцианов, нафтохинонов, антрахинонов и производных шиконина [59]. В научных публикациях имеются данные о влиянии различных типов регуляторов роста и их синтетических аналогов на накопление биомассы и вторичных метаболитов в культуре-продуценте тритерпеновых гликозидов Panax giensheng. При воздействии производных фенолоксиуксусных кислот (ФОУК) отмечен более активный рост каллуса, который значительно отличается от роста на питательных средах, дополненных α- и β-НУК, а также ИМК. Показано, что уменьшение количества атомов хлора в молекуле ФОУК от 1 до 3 снижает содержание специфических гликозидов, обнаруживаемых при действии 4-хлорфеноксиуксусной кислоты (4-CPA) [169]. Имеются сведения об ингибирующем действии НУК (по сравнению с 2,4-Д) на биосинтез флавоноидов в каллусных культурах чайного растения [111]. В целом, 2,4-Д чаще, чем ИУК и НУК, замедляет синтез вторичных соединений, что, по-видимому, связанно со снижением содержания в клетках глутамата и аспартата, играющих важное значение в синтезе вторичных метаболитов [45, 46, 107, 111, 115, 158, 159].
- Цитокинины. Наиболее часто используемыми цитокининами в культуре тканей и клеток растений является 6-фурфурилметиламинопурин (кинетин) и 6-бензиламинопурин (6-бензиладенин, 6-БАП), которые тоже оказывают видоспецифичное воздействие на обмен вторичных соединений in vitro. Так, кинетин способствовал накоплению никотина в культуре клеток табака; – скополетина, скополина, суммы фенолкарбоновых кислот и хлорогеновой кислоты – в культуре скополии [190, 235, 243, 251]. В каллусе льна кинетин усиливал образование п-кумаровой и феруловой кислот, а в каллусе сои – суммы фенольных соединений. При культивировании каллуса Cassia tora кинетин повышал содержание антрахинонов [236]. Этот же цитокинин использовался для получения культур клеток Coptis japonica (Thunb.) Makino, Rauwolfia serpentina (L.) Benth. exKurz, CamptothecaacuminataDecne. и других культур, которые продуцируют алкалоиды имеющие различное строение [35]. Низкие концентрации цитокининов (10-8 М) оказывали стимулирующее действие на синтез стероидных сапогенинов в культуре Solanum aviculare G. Forst. и алкалоидов в культуре тканей скополии [27, 107, 115]. Кинетин и изопентенил (2ip) в присутствии 4-CPA ингибировали рост каллуса и снижали синтез гинзенгозидов у женьшеня [169]. Кинетин, по данным М. Н. Запрометова, способствует накоплению фенольных соединений в культуре чайного растения, хотя его действие проявлялось слабее, чем у НУК. Это, по-видимому, связанно со специфическим стимулирующим действием дпанного цитокинина на фенилпропаноидный обмен [59]. Наряду с этим в литературе имеются данные и о противоположном эффекте действия цитокининов на содержание вторичных метаболитов в культуре тканей растений. Так, в культуре Nicotiana tabacum кинетин в концентрациях выше 10-5 М полностью ингибировал синтез метаболитов [107, 115]. При этом каллусные культуры Panax giensheng, прототрофные по цитокининам, при культивировании на средах с высоким содержанием зеатина (25 и 75 мг/л) накапливали больше тритерпеновых гликозидов, чем исходные культуры на среде без цитокининов [164, 169].
- Другие фитогормоны. Роль других гормональных факторов в регуляции синтеза вторичных метаболитов изучено плохо. В имеющихся научных публикациях показано, что гибберелловая кислота (ГА3) подавляла образование антоцианов и лигнина, но не оказывала влияния на синтез проантоцианидинов. Абсцизовая кислота угнетала рост и образование растворимых фенольных соединений и лигнина в клетках Acer pseudoplatanus. и табака [35, 59, 107, 115].
pH питательной среды. Данные о влиянии этого фактора на синтез вторичных соединений малочисленны. Их отсутствие определяется определенной сложностью контроля данного фактора в процессе эксперимента. Однако, по имеющимся сведениям, pH среды оказывает значительное воздействие на биосинтез вторичных метаболитов. Например, при изучении синтеза индольных метаболитов (триптофан, триптофол) в культуре клеток ипомеи в условиях строгого контроля значения рН оказалось, что при pH 6,3 синтез индолов максимален и в два раза превышает уровень синтеза без контроля рН. При pH 4,8 синтез индолов полностью прекращался. В условиях pH-статированного эксперимента получают лигнаны из каллусных культур ипомеи [224]. В то же время в культивируемых тканях мака прицветникового при изменении pH питательной среды содержание алкалоидов возрастало в первые же часы культивирования и сохранялось длительное время в условиях контроля значения pH [140].
Действие предшественников. Накопившиеся к настоящему времени данные свидетельствуют о том, что лишь в редких случаях синтез вторичных метаболитов может быть значительно усилен путем введения в культуральную среду их предшественников [70]. Это означает, что в большинстве случаев подавление образования того или иного вещества в культурах клеток не связано с недостатком выработки соответствующих предшественников. Введение в культуральную среду далеких и близких предшественников фенольных соединений не приводило к усилению выхода специфических метаболитов в культуре чайного растения [56, 58]. Добавление в среду далекого предшественника (тропина) не стимулировало выход тропановых алкалоидов в культуре клеток Datura sp. [235]. Подобные данные были получены М. Н. Ценком с сотрудниками при работе с культурой клеток Morinda citrifolia. Однако добавление в среду непосредственного предшественника привело к увеличению выхода целевого продукта. На примере клеток Galium mollugo L. было установлено, что потеря способности к образованию иридоидных гликозидов не связана с недостатком предшественников (сахаров и мевалоновой кислоты), поскольку эти соединения эффективно использовались в биосинтезе антрахинонов [59]. Как показала практика, добавление предшественников различных уровней типа холестерина, дрожжевого экстракта, L-лейцина, L-серина или холина к суспензионным культурам диоскореи оказывали отличающиеся друг от друга воздействия. Так, дрожжевой экстракт сильно ингибировал рост клеток и биосинтез диосгенина, при этом лейцин стимулировал только биосинтез фитостерола. Добавление к среде серина и холина стимулировало аккумуляцию диосгенина, увеличивая ее на 200 % в расчете на 1 г сухой массы ткани [195].
Физические факторы культивирования. Данные о воздействии их на выход вторичных метаболитов немногочисленны. К таким факторам относят условия культивирования клеточных популяций: температуру, аэрацию, освещенность, наличие посторонних физических агентов (мешалок при глубинном культивировании и иммобилизаторов при иммобилизации клеток).
Аэрация. Это один из важных факторов регулирующих как основной, так и вторичный метаболизм, но экспериментальных данных по его влиянию очень мало. Особое значение имеют как расход кислорода, так и соотношение СО2/О2. Высокое соотношение О2/СО2, по мнению А. М. Носова, может ингибировать как рост, так и накопление вторичных метаболитов [98, 115].
Температура. Сведения о влиянии температуры на синтез вторичных соединений были представлены лишь в нескольких работах. Авторами показано, что оптимум синтеза никотина в клетках табака находится при температуре 270С, а отклонение на 50С в любую сторону приводит к снижению синтеза более, чем в три раза [115].
Свет. Воздействию этого фактора посвящено большое количество исследований. При этом разбирается как полная индукция синтезов, так и влияние на количество соединений качественного состава света. Так, свет индуцировал образование антоцианов в культивируемых клетках Haplopappus gracilus (Nutt.) A. Gray, при этом наиболее эффективным являлся его синий спектр. Синтез катехинов и проантоцианидов в каллусе и суспензии Crataegus sp. и Ginkgo biloba L. происходит только на свету [8, 59, 86, 248]. Под влиянием света увеличивалось содержание серпентина в барвинке, витамина В6 и суммы алкалоидов в дурмане и руте [8]. Красный свет усиливал продукцию подофиллотоксина культивируемыми клетками подофила [204]. При воздействии ультрафиолетовой радиации каллус петрушки начинал синтезировать фенольные гликозиды, а в культуре чайного растения накапливалось в 2-2,1 раза больше соединений полифенольной природы, чем в темноте [54]. Свет повышал выход кофеина в клетках культуры Coffea arabica [213]. Достаточно часто свет изменяет соотношение накапливаемых веществ. По-видимому, активирующее действие света связано с синтезом de novo белков-ферментов на основе синтеза de novo м-РНК, который регулируется фитохромной системой [59, 82]. В ряде публикаций имеются данные об ингибирующем действии света на синтез вторичных соединений. Синтез гиосциамина и скополамина в культуре дурмана происходит только в темноте [115]. Освещение снижает содержание алкалоидов в культуре хинного дерева, шиконина – в культуре воробейника [107, 241].
В связи с выше перечисленным можно предложить следующую стратегию контроля синтеза вторичных метаболитов в условиях in vitro: 1). Влияние на рост и пролиферацию клеток в культуре. В основе этого способа лежит идея о том, чтобы сделать невозможным или изменить степень выполнения культивируемыми клетками своей основной задачи – деления. При этом изменения основного метаболизма клеток может привести к началу синтеза вторичных метаболитов. Такая закономерность отмечается довольно часто, при этом существуют указания на целесообразность угнетения или лимитирования процесса деления клеток с помощью ингибиторов трансляции и транскрипции ДНК и РНК. Такие действия приводят к накоплению и повышению выхода алкалоидов в культурах Macleauasp. и Nicotianasp. [167]. 2). Поиск сигнальных факторов, посредством которых происходит управление синтезом вторичных метаболитов в культуре клеток. Его целесообразно проводить в нескольких направлениях:
- с учетом того факта, что многие вещества вторичного метаболизма выполняют протекторные функции, например, флавоноидов, сигналом к синтезу которых могут стать неблагоприятные условия среды. Такие факторы, как дефицит определенных компонентов среды, гипоксия, воздействие низких температур, избыточное осмотическое давление могут приводить к повышению содержания вторичных метаболитов в культивируемых клетках [59, 107, 115];
- для соединений, имеющих защитные свойства, например, фитоалексинов, можно предположить, что сигналы, работающие в интактном растении, могут оказаться полезными и эффективными в культуре клеток [167].;
- наиболее эффективным способом контроля за синтезом вторичных соединений в культуре является поиск путей изменения их функций, т. е. возможность создания условий, в которых соединения специализированного обмена могут играть роль индуктора делений. Так, в клетках диоскореи присутствующие фуростаноловые гликозиды положительно влияют на деление и рост клеток и, как следствие, индуцируют свой синтез [21].
Таким образом, для получения культур-продуцентов вторичных метаболитов необходимо соблюдение нижеперечисленных условий:
- выбор растения-донора, в котором содержание метаболитов будет максимальным по сравнению с другими сходными видами;
- выбор органа или ткани с максимальным содержанием продукта специализированного обмена;
- использование различных мутагенов и селективных факторов, приводящих к повышению выхода метаболитов;
- оптимизация условий выращивания культур с целью получения клеточной биомассы, для последующего перевода на среду, предназначенную для накопления метаболитов;
- использование специализированных веществ, усиливающих синтез вторичных соединений (например, элиситоров – компонентов патогенных организмов).
Автор фото в статье: Ляпустина Е.В.
Ссылки на литературу в тексте соответствуют источнику.
Источник: Сидякин А.И., Индуцированный морфогенез in vitro и накопление тритерпеновых гликозидов в каллусных культурах ломоноса виноградолистного (Clematis vitalba L.): Дис. … канд. биол. наук. Симферополь. 2011. – 217 с.
Материал любезно предоставил Сидякин Андрей Иванович – к.б.н., ас. каф. ботаники и физиологии растений и биотехнологий и м.н.с. Биотехнологического центра НИЧ Таврического национального университета им. В.И. Вернадского, научный консультант ООО КрымБио