Рекомендовано применение 70%-го этилового спирта в экспозиции 1-30 с для уничтожения посторонней микрофлоры и для доращивания жизнеспособных зародышей и развития эндосперма. Раствор сулемы может губительно действовать на доращивание эмбрионов и развитие эндосперма. Отмечено, что применение 96%-го этилового спирта может негативно влиять на доращивание эмбрионов.
Введение
Кукуруза – это культура, которая имеет большие потенциальные возможности в получении высоких урожаев, а также многообразие хозяйственного использования. Кукуруза – одна из наиболее распространенных культур в мировом растениеводстве. По урожайности зерна превосходит все зерновые культуры. В зерне кукурузы содержится 65-70% углеводов, 9-12% белка, 4-8% растительного масла (в зародыше до 40%) и лишь около 2% клетчатки. Зерно содержит витамины А, В1, В2, В6, Е, С, D, F, незаменимые аминокислоты, минеральные соли и микроэлементы. Зерно кукурузы используется на кормовые, пищевые, технические и медицинские цели. Из него изготавливают более 150 пищевых и технических продуктов [4, 5]. Фармацевтическая отрасль использует кукурузное масло, полученное из зародышей, которое обогащено витаминами A, B, C, D, E, F, как растворитель для биологически активных веществ и как средство, способствующее профилактике и лечению различных заболеваний [4, 5, 8].
Проблема увеличения производства зерна кукурузы остается одной из актуальных задач аграрного производства. Главный резерв увеличения валовых сборов зерна заключается в повышении урожайности на основе эффективного использования генетических возможностей новых и перспективных гибридов. Их создание требует интенсификации селекционного процесса на основе широкого использования результатов исследований по биотехнологии, молекулярной биологии, генной инженерии и др. Известно, что результаты биотехнологических разработок способны существенно влиять на различные стороны селекционного процесса. Это может быть увеличение генетического разнообразия исходного материала, оптимизация процессов отбора, размножения ценных генотипов и другие технологии, основанные на использовании методов генетической и клеточной инженерии. Среди этих направлений особое место занимают биотехнологии, нацеленные на ускорение процесса селекции. Значительное ускорение создания новых линий и гибридов в кукурузы может быть достигнуто за счет использования эмбриокультуры in vitro [6]. Эмбриокультура – культура зародышей предусматривает культивирование зародышей кукурузы на искусственной питательной среде, что требует стерильных условий. Изолированные растительные органы, ткани и клетки могут успешно расти на искусственных питательных средах при условии отсутствия конкуренции их с микроорганизмами. Стерилизация растительных объектов заключается в уничтожении грибных и бактериальных спор на внешней поверхности без повреждения внутренних клеток. Вид стерилизующей вещества, его концентрация и продолжительность обработки зависят от плотности и чувствительности материала, подлежащего стерилизации [1, 7]. Правильный выбор стерилизующего вещества заключается в том, что оно должна губительно действовать на все микроорганизмы и в то же время минимально повреждать ткани объекта и не влиять на продуктивность семян. Важным условием является то, что стерилизующее вещество должно легко удаляться из тканей промывкой дистиллированной водой или подвергаться разложению. Для поверхностной стерилизации растительных тканей применяют широкий набор химических веществ. Широко используются соединения, содержащие активный хлор (гипохлорит натрия и кальция, хлорная известь, хлорамин), двухлористая ртуть (сулема), а также применяют перекись водорода, этиловый спирт, реже – бром, серную кислоту и в особых случаях для стерилизации используют антибиотики [12, 13]. Чаще всего в биотехнологии растений применяют сулему и этанол для стерилизации различных тканей и органов растений, в том числе кукурузы. Известно, что получить положительные результаты по стерильности культуры семян возможно при использовании метода стерилизации исследуемого материала ряда культур с применением 0,1%-го водного раствора сулемы в течение 10-20 мин [2] или – 1-2 мин при проведении предварительного замачивания материала [3]. Но было доказано, что эти методы не всегда и не со всеми культурами дают удовлетворительные результаты и недостаточно эффективны и нецелесообразны вообще [7, 9,12, 13]. Кроме того, все растворы, содержащие активный хлор, применяются для одноразового использования.
Этиловый спирт обычно применяется для предварительной стерилизации объектов и улучшения действия других стерилизующих средств, а также – для стерилизации плодов, семян, ростков, завязей. Этиловый спирт для стерилизации материала применяют в концентрациях 50, 70 и 96%. Единого мнения относительно эффективности указанных концентраций спирта не существует. Одни исследователи рекомендуют 96% этиловый спирт [2, 7], а другие считают, что использование 50-70%-го этилового спирта является более эффективным [1, 11, 15]. Есть свидетельства о применении 75% этилового спирта для стерилизации исследовательского растительного материала табака [14].
Для получения удовлетворительных результатов используют уже известную технику стерилизации данного объекта или разрабатывают ее экспериментально для каждого конкретного случая, так как один и тот же орган у различных растений требует различных условий стерилизации [9, 12, 13]. В связи с этим, целью исследования было проверить стерильность культуры изолированных незрелых зерновок и зародышей кукурузы при различных способах стерилизации, установить влияние стерилизующих реагентов на созревание зародышей и развитие эндосперма в культуре зерновок.
Материал и методика исследований
Материалом исследования послужили изолированные незрелые зерновки раннеспелой инбредной линий кукурузы ДК366 в возрасте 5 суток после опыления. Початки отделяли от донорных растений и поверхностно стерилизовали. Опыт был поставлен в пяти вариациях, по пятьдесят зерновок на вариант. Стерилизацию проводили с разнообразным сочетанием наличия оберток початка, обработки 70%-ным, 96%-ным этиловым спиртом и 0,1%-м водным раствором сулемы. Схема опыта представлена в табл. 1. Во время стерилизации початки, что стерилизовали в обертках, содержали одну–две обертки и обрабатывали целиком. Початки, которые обрабатывали без оберток, разрезали на секции по 3 см. После обработки стерилизующим веществом исследуемый материал промывали в стерильной дистиллированной воде три раза по пять минут. Хранили материал в последней промывной воде до введения его в культуру in vitro. Анализ на наличие инфекции осуществляли со второго дня посадки до пятидесяти дней в культуре.
Зерновки эксплантировали на питательную среду в стерильных условиях ламинар-боксов. Культивирование осуществляли на модифицированной питательной среде NBM по R. Mol et al. [16], которая вмещала макросоли N6, микросоли B5, 0,1 мг / л тиамина гидрохлорида, 0,5 мг / л пиридоксина гидрохлорида 0,5 мг / л никотиновой кислоты, 90 г / л сахарозы, 1 мг / л 6 -бензиламинопурина и 7 г / л агара. Культивирование проводили в чашках Петри, по 10 зерновок на чашку при температуре 260С в темноте. Анализ стерильности культуры зерновок и созревания зародышей и формирование эндосперма в этих зерновках проводили на пятидесятые сутки в культуре. Развитие зерновок in vitro оценивали по таким показателям как наличие и состояние развития зародыша, состояние эндосперма и наличие в нем крахмала. Временные препараты для выявления крахмала в эндосперме красили реактивом Люголя. Морфометрический анализ зародышевых мешков и зародышей проводили под микроскопами МБС-1 и ЛОМО МИКМЕД-5, микрофотографии получены с помощью фотоаппарата Canon PowerShot A590 IS.
Результаты исследований и обсуждение
Все исследуемые варианты поверхностной стерилизации дали 100% стерильность культуры изолированных зерновок (табл. 2). Отмечено агрессивное действие 96%-го этилового спирта и 0,1%-го водного раствора сулемы, вызывающие поражение верхних тканей материала – побурение и отмирание. Установлена вероятность доращивания зародышей и развитие эндосперма в культуре зерновок в зависимости от варианта стерилизации материала (табл. 2).
На момент эксплантации зерновка вмещала зародышевый мешок и зародыш, который находился на глобулярной стадии. Эндосперм в настоящее время находится в процессе клеткообразования, крахмал в эндосперме отсутствует. В результате культивирования были получены сформированные зачатки правильного строения и деформированные. Сформированные зародыши правильного строения содержали развитый щиток, плюмулу и точки роста стебля и корня. Зачатки неправильного строения были деформированы за счет разрастания лопастей щитка, все остальные органы были в норме. При следующей регенерации зачатки дали крепкие зеленые проростки с хорошо развитой корневой системой. Зародыши, находившиеся на глобулярной и переходной стадии, при подсчетах не учитывались. На момент анализа эндосперм, который был развит, содержал глобулы крахмала в своем составе. Эндосперм был белый, плотный.
Зародыши, что были получено в культуре изолированных зерновок при вариантах поверхностной стерилизации № 2 и № 4, с применением 0,1%-го водного раствора сулемы, были деформированными (сформированные, но неправильного строения). Наблюдалось также подавление развития эндосперма при обработке материала раствором сулемы (табл. 2). Отмечено неоднозначное влияние обработки 96%-ным этиловым спиртом на доращивание эмбрионов и развитие эндосперма. При его использовании (вариант № 1) были получены зародыши правильного и неправильного строения, но в небольшом количестве, эндосперм же при этом развивался достаточно хорошо и интенсивно накапливал крахмал (табл. 2). Применение 70%-го этилового спирта (варианты № 3 и № 5) способствовало формированию зародышей правильной строения и развитие эндосперма (табл. 2). Так было обнаружено, что 70%-ный этиловый спирт максимально удовлетворяет потребность в обеспечении стерильности культуры зерновок и зародышей, изолированных из них и не подавляет развитие зародышей, эндосперма и накопления в его клетках крахмала.
Выбранная методика поверхностной стерилизации была применена для дальнейших исследований при работе в культуре in vitro. При культивировании других эксплантатов (сегментов початков с зерновки, зародышевых мешков и зародышей) разного возраста и генотипов, инфекция проявлялась, но не была системной и не зависела от выбранного варианта поверхностной стерилизации опытного материала. Однако, при работе в культуре in vitro в более поздние сроки времени года, а именно конец августа — сентябрь, увеличивается масштабность инфицирования растений кукурузы и исследуемого материала. Это связано с жизнедеятельностью вредителей и болезней растений кукурузы (головня, гусеница, тля, стеблевая гниль, плесневение семян и ростков, головня, фузариоз), которые проявляются при более поздних сроках созревания в полевых условиях [10]. Поэтому, время экспозиции в 70%-м этиловом спирте, при поверхностной стерилизации исследуемого материала, возможно продлевать от 30 с до 10 мин, с обязательным последующим трехкратным промыванием в дистиллированной воде, что не противоречит результатам предыдущих работ [11, 15].
Заключение
Все исследованные методы поверхностной стерилизации материала с применением 0,1%-го водного раствора сулемы, 96%-го и 70%-го этилового спирта, дают 100% стерильность культуры зерновок кукурузы in vitro и зародышей, изолированных из них. Установлено, что применение 70%-го этилового спирта в экспозиции 1-30 с является благоприятным и для уничтожения посторонней микрофлоры и для доращивания жизнеспособных зародышей и развитие эндосперма. Раствор сулемы может губительно действовать на доращивание эмбрионов и развитие эндосперма. Отмечено, что применение 96%-го этилового спирта может негативно влиять на доращивание эмбрионов.
Список литературы
- Божков А.И. Биотехнология. Фундаментальные и промышленные аспекты. – Харьков: Федорко, 2008. – 363 с.
- Калинин Ф.Л., Сарнацкая В.В., Полищук В.Е. Методы культуры тканей в физиологии и биохимии растений. – К.: Наук. думка, 1980. – 488 с.
- Клейн Р.М., Клейн Д.Т. Методы исследования растений: Пер. с англ. / Ред. В.И. Мельгунова. – М.: Колос, 1974. – 528 с.
- Лихочвор В.В. Рослинництво. Технології вирощування сільськогосподарських культур. – К.: Центр навчальної літератури, 2004. – 808 с.
- Мартынов С.М. Лечебное растение // Кукуруза и сорго. – 1989. – № 4. – С.47-50.
- Сатарова Т.Н., Пиралов Г.Р., Дзюбецкий Б.В. Ускорение селекционного процесса кукурузы с помощью метода эмбриокультуры // Вісник аграрної науки. – 1993. – № 8. – С.50-53.
- Тюкавин Г.Б. Основы биотехнологии моркови: Монография. – М.: ВНИИССОК, 2007. – 480 с.
- Хоменко В., Марян В. Шрот, олія та ліки із зародків кукурудзи // Зерно і хліб. – 2003. – № 1. – С.32.
- Черевченко Т.М., Лаврентьева А.Н., Иванников Р.В. Биотехнология тропических и субтропических растений in vitro. – К.: Наук. думка, 2008. – 559 с.
- Чернобай Л. М. Сажкові хвороби кукурудзи // Агроном. – 2005. – № 1. С.36–39.
- A novel technique for the partial isolation of the maize embryo sacs and subsequent regeneration of plants / Laurie J.D., Zhang G., McGann I.E. et al. // In Vitro Cell. Dev. Biol. – Plant. – 1999. – Vol.35. – P.320-325.
- Bhojwani S.S., Razdam M.K. Plant tissue culture: theory and practice – Elsevier Science: Netherlands, 1996. – 749 p.
- Burun B., Coban P.E. Embryo culture in Barley (Hordeum vulgare L.) // Turk J. Biol. – 2002. – Vol.26. – P.175-180.
- Hе Y., Sun M., Yang H. Regeneration of fertile plants from isolated tobacco zygotes by in vitro culture // Chinese Science Bulletin. – 2004. – Vol.49. – № 8. – Р.810-814.
- In vitro development of maize immature embryos: a tool for embryogenesis analysis / Matthys-Rochon E., Piola F., Deunff E. et al. // J. Exp. Bot. – 1998. – Vol.49. – № 322. – P.839-845.
- Mol R., Matthys-Rochon E., Dumas C. In vitro culture of fertilized embryo sacs of maize: zygotes and two-celled proembryos can developed into plants // Planta. – 1993. – Vol.189. – № 2. – P.213-217.
Источник: Ляпустіна О. В. Стерилізація ізольованих зернівок кукурудзи як етап в технології їх дорощування в культурі in vitro / О. В. Ляпустіна, І. М. Зубарева // Вопросы химии и химической технологи. – 2010. – №3. – С. 42-45.
Автор фото в статье: Ляпустина Е.В.