Культуры клеток растений, выращиваемые в жидкой питательной среде, обычно называют суспензионными культурами. Популяции свободноживущих клеток являются удобной и ценной моделью для всестороннего и глубокого изучения физиологических закономерностей роста, дифференциации, регуляции определенных сторон клеточного метаболизма соматических клеток высших растений. Особенно важно использование биосинтетического потенциала растительных клеток с целью промышленного получения при крупномасштабном культивировании ряда экономически ценных веществ – алкалоидов, стероидных соединений, гликозидов, эфирных масел, ферментов и др.
Растительные суспензионные культуры, состоящие из одиночных клеток, небольших групп и клеточных агрегатов, выращиваются во взвешенном состоянии в аэрируемой жидкой питательной среде определенного состава. Для этого применяют разные аппараты и способы поддержания их в таком состоянии. Начальный момент получения суспензионной, клеточной культуры является событием рандомическим. Это означает, что только клетки, которые по ряду причин способны к перестройке метаболизма и делятся с высоким коэффициентом в данных конкретных условиях суспензионного культивирования, образуют «хорошие» линии. Оптимальные характеристики таких линий: высокая степень дезагрегации (5-10 клеток в группе), морфологическая выравненность клеток (небольшие размеры, сферическая или слегка овальная форма, плотная цитоплазма), отсутствие трахеиподобных элементов.
Получение, субкультивирование и поддержание суспензионных культур
Обычным способом получения клеточной суспензии является перенос каллусной ткани в жидкую питательную среду, в колбу, которая затем помещается на качалку или в специальные сосуды, перемешивание в которых производится с помощью роллеров разного типа. Инициация суспензионной культуры требует 2-3 г свежей каллусной ткани на 60-100 мл жидкой питательной среды. Скорость перемешивания для получения первичной суспензии на круговой качалке – 100-120 об/мин.
Суспензионную культуру можно получить и прямо из фрагмента органа растения, например дисков запасающей паренхимы корнеплодов моркови, клубней картофеля и др. (Stewardet. al., 1958), однако такой путь более трудный и длительный. Клетки экспланта должны образовать первичный каллус, и только после этого поверхностные каллусные клетки, попавшие в жидкую среду и размножившиеся в неи, дадут начало линии, способной расти в суспензии. Иногда суспензионную культуру инициируют определенным количеством гомогената ткани, содержащего живые и разрушенные клетки.
Более пригодными для получения суспензии клеток являются рыхлые, обводненные культуры каллусных тканей. Однако суспензию можно получать и из других типов тканей, уменьшив механическую стабилизацию соседних клеточных стенок. Удаление пектината кальция — основного связующего материала растительных клеток, должно приводить к их распаду. Это может быть осуществлено путем изъятия кальция из среды ферментативно или связыванием его хелатами.
К настоящему времени общеизвестно, что «разрыхлить» каллус можно с помощью исключения из питательной среды солей Са (в том числе витамина — пантотената кальция). Для этой же цели можно в качестве ауксина применить при выращивании 2,4-Д и, наконец, добавить в питательную среду ферменты — 0,2 мг/л пектиназы и 0,1 мг/л целлюлазы. Последнее, как правило, позволяет добиться значительно разрыхления каллуса.
Одним из основных параметров культуры клеточных суспензий является минимальное время удвоения клеточной популяции. Для накопительной суспензионной культурЬ1 некоторых видов растений было определено время удвоения популяции. Оказалось, что минимальное время удвоения клеток в накопительной культуре составляет 22-96 часов в то время, как продолжительность клеточного цикла делящейся меристемы растений – всего 8-20 часов (Калинин и др., 1980). Для клеточной культуры моркови время удвоения популяции составляет 48 часов (Nishietal., 1977).
В исследованиях по изучению роста растительных суспензионных культур обычно проводят определение веса сырого и сухого вещества клеток, их количества, объема уплотненных клеток, размера клеток, их среднего объема, содержания белка.
Как правило, клеточная популяция суспензионных культур асинхронна и содержит клетки, различающиеся по времени вхождения в митоз, что создает определенные трудности для получения достаточного количества клеток, находящихся на одной стадии развития. Кроме того, получению высокой степени синхронности клеточной популяции в значительной степени препятствует гетероплоидность, обычная для культивируемых растительных клеток (Шамина, 1970).
Изучение особенностей размножения и роста клеток значительно облегчается, а иногда становится единственно возможным при использовании синхронизированных клеточных популяций. Такие клеточные системы открывают широкие возможности для исследования регуляторного влияния химических и физических факторов на клеточный цикл, длительность его индивидуальных фаз (Gj, S, G2и митоза), кинетику синтеза определенных макромолекул. Это особенно важно для характеристики мутагенных факторов, воздействующих на синтез ДНК, РНК, гистонов и определенных ферментов.
Индукторами синхронизации в системе in vitro могут быть ингибиторы синтеза ДНК или митоза, гормоны, голодание, действие пониженной температуры. С помощью этих факторов можно получить культуры с митотическим индексом до 30%, тогда как в обычных условиях он составляет 3%.
Источник: Тюкавин Г. Б. Основы биотехнологии моркови: Монография / ВНИИССОК. – М., 2007. – 480 с.
Автор фото: к.б.н., Аверчева О.В.