Вторичный метаболизм культивируемых клеток высших растений привлекает все большее внимание исследователей. Это обусловлено, прежде всего, перспективностью промышленного использования культивируемых клеток растений для получения соединений вторичного обмена растений [113, 121, 199, 211, 226]. Особую актуальность этот вопрос приобретает в связи с ухудшением экологической обстановки. По данным литературы, только в медицинской практике около трети всех применяемых лекарственных средств содержит вещества растительного происхождения [110]. Если также учитывать возрастающие потребности пищевой, косметической и сельскохозяйственной промышленностей, то становится очевидным необходимость замены растительного дикорастущего сырья, добываемого традиционным способом, на гарантированно получаемую биомассу культивируемых клеток, содержащую определенные соединения в достаточном количестве.
Первое сообщение о синтезе каучука появилось в 40-х годах 20-го столетия [59]. Однако многолетние исследования вопросов синтеза вторичных веществ в культуре тканей не дали ответа на вопрос: возможна-ли разработка единой общей стратегии управления синтезом вторичных веществ или в культуре тканей необходима стратегия индивидуальная для каждого конкретного случая. За время изучения синтеза вторичных метаболитов в культуре клеток растений накопился большой объем информации, на основе которой можно выделить следующий ряд закономерностей:
- культивируемыми клетками растений могут быть синтезированы практически все классы соединений вторичного обмена. К концу 70-х годов было известно уже более 100 соединений, обнаруженных в культуре клеток [89, 167];
- первичные культуры клеток часто содержат лишь незначительные количества соединений вторичного обмена или не содержат их вовсе. Однако, количество этих соединений можно значительно повысить путем оптимизации среды культивирования, клонирования, мутагенеза и скрининга [8, 9, 21];
- до сих пор не удается получить в культуре вещества, имеющие сложную структуру, поскольку, чем сложнее вещество и чем больше специфических этапов его синтеза после отделения от основного пути первичного метаболизма, тем менее вероятен синтез его в культуре [85, 90];
- накопление производных вторичного метаболизма приурочено к определенной фазе роста клеточной культуры. Чаще всего накопление идет в стационарной фазе роста каллусной или клеточной культуры [89, 107, 113, 115, 140, 207];
- в ряде случаев синтез вторичных соединений начинается только при появлении в клеточной культуре дифференцированных структур [8, 12, 20, 25, 69, 86, 90, 107, 115];
- стабильность и спектр синтезируемых веществ неодинаков. Может наблюдаться временная нестабильность синтеза (для некоторых стероидных гликозидов), также показана способность клеток в культуре синтезировать вещества, нехарактерные для интактного растения, например, в культуре тканей Cryptocarpa chinensis L. впервые выделена N-мето соль кариахина, которая в интактных растениях не встречается [194]. Вместе с этим в культурах клеток обнаруживаются вещества, характерные для ювенильных растений [113-115].
Обобщая данные научной литературы, можно предположить, что для получения каллусных и суспензионных культур-сверхпродуцентов веществ вторичного метаболизма растений в условиях in vitro необходимым условием является соблюдение определенной схемы.
Выбор вида растения. Данный пункт схемы подразумевает отбор при введении в культуру in vitro тех видов, в которых содержание конкретного метаболита будет изначально выше, чем в других сходных по составу видах растений [21].
Отбор генотипа исходного растения. Классическим примером важности этого этапа является эксперимент по получению культур Catharanthus roseus с высоким содержанием алкалоидов серпентина и аймалицина, проведенный M. N. Zenk’ом с сотрудниками [245]. Для этого ученые использовали 184 образца семян из различных мест произрастания. Из полученных проростков отобрали наиболее перспективные (богатые алкалоидами) и получили из них каллусные культуры. Каллусы перевели в суспензионные культуры клеток. Последние пересадили на агаризованные среды из большого количества колоний, выполнив огромное количество аналитических операций, отобрали самые лучшие для возврата к суспензионным культурам. Эти суспензионные культуры сохранялись на средах, максимально благоприятных для роста клеток. Для получения алкалоидов их пересевали на другую среду, которая способствовала их максимальному образованию. В результате работы были получены два штамма клеток. Один из них синтезировал большое количество одного серпентина (162 мг/л), второй – меньшее количество серпентина (77 мг/л), но зато очень много аймалицина (264 мг/л). При этом образование серпентина в исходных культурах не превышало 10 мг/л. Подобными методами, в концу 70-х годов, были получены более 16 культур клеток-сверхпроизводителей вторичных метаболитов, относящихся к более чем 10 классам соединений [167].
Эпигенетика экспланта. Очень часто в культуре тканей проявляются признаки эпигенетического характера. К эпигенетическим признакам относятся те проявления в метаболизме свободно живущей клетки in vitro, которые передаются в ряду клеточных поколений и которые связанные с клеточной дифференцировкой, как реализацией тотипотентности меристематической клетки при образовании органов и тканей [8, 9 20, 37, 49, 59, 73, 86, 89, 90, 107]. В ряде случаев клеточные культуры синтезируют вещества характерные для ткани экспланта. Например, культура клеток подофилла, полученная из корня растения, содержала подофиллотоксин, тогда как в культуре клеток стеблевого происхождения он отсутствовал [204]. Содержание диосгенина в культуре полученной из корневищ Dioscorea sp., Dioscorea composita Hemls., и D. tokoro Makino., был на порядок выше, чем в культуре полученной из побегов [26, 27, 218, 244]. Подобная зависимость прослеживается в культурах N. tabacum и Catharanthus roseus [188, 190, 242, 245, 246, 200]. Однако в культуре клеток и тканей, независимо от их эпигенома чаще всего проявляется тотипотентность клеток [21]. Так по данным А. С. Воробьева [26] клеточная культура Dioscorea deltoidea содержит два фуростаноловых гликозида – протодиосцин, характерный для листа, и дельтозид, характерный для корневища интактного растения [32]. По данным Р. Г. Бутенко и А. Г. Воллосовича культура клеток раувольфии змеиной стеблевого происхождения содержит как основой алкалоид стебля серпентин, так и аймалицин, находящийся в корне интактного растения [30].
Различные манипуляции с культурой in vitro. Культуры клеток растений характеризуются высокой гетерогенностью клеток в популяции [89, 90, 150, 168, 193, 206]. При этом гетерогенность наблюдается на разных уровнях организации генома клетки [91, 92]. Изменения генома клетки происходят на различных уровнях – на уровне точковых мутаций, хромосомных перестроек, наборов хромосом и, наконец, цитоплазматических генов. В качестве основных причин гетерогенности выдвигаются следующие предположения: а) гетерогенность генетической информации в эксплантах, б) мутационный эффект компонентов питательной среды, в) отсутствие корреляционных связей и контроля со стороны целого организма [89, 90, 168]. Гетерогенность позволяет с помощью клонирования отбирать клеточные линии и клеточные штаммы с сильно измененными основными свойствами, в частности, с повышенным синтезом вторичных соединений. При этом накопление спонтанных мутаций (сомаклональной изменчивости клеток) в ходе культивирования постепенно приводит к доминированию мутантных форм клеток над немутантными, особенно если это связанно с более высокими темпами роста сомаклонов. Таким способом, путем направленного и ненаправленного отбора были отобраны штаммы-продуценты шиконина, аймалицина, серпентина, берберина [196, 226, 238, 245, 247]. Однако, по данным литературы, при длительном культивировании часто происходит накопление новых мутаций, которые могут значительно снизить выход необходимого продукта [4, 8, 9]. Значительные изменения генома отмечены при использовании методов индуцированного мутагенеза и воздействия селективных факторов. В этом случае в полученных мутантных штаммах отмечается склонность к усиленному синтезу вторичных метаболитов [132, 150]. При применении химических мутагенов в работе с культурой Dioscorea deltoidea были получены несколько штаммов с более высокими скоростями роста биомассы и повышенным выходом стероидных гликозидов, спектр и количество которых значительно отличались от исходной линии [65, 66]. При использовании в качестве действующего селективного фактора на культуру клеток раувольфии 5-метилтриптофана на фоне гибели большинства клеточных агрегатов удалось получить устойчивые к этому веществу жизнеспособные штаммы. Полученные штаммы синтезировали больше основных алкалоидов, чем исходные культуры [94]. При обработке культуры клеток Acer pseudoplatanus п-фторфенилаланином были получены штаммы, которые синтезировали либо очень большие количества фенилаланина, либо очень высокие количества фенольных соединений [59]. При обработке культуры диоскореи N-нитрозо-N-метилмочевиной с использованием в качестве селективного фактора 25-оксихолестерина получены культуры сверх-продуценты стероидов [21, 65, 89].
Автор фото в статье: Ляпустина Е.В.
Ссылки на литературу в тексте соответствуют источнику.
Источник: Сидякин А.И., Индуцированный морфогенез in vitro и накопление тритерпеновых гликозидов в каллусных культурах ломоноса виноградолистного (Clematis vitalba L.): Дис. … канд. биол. наук. Симферополь. 2011. – 217 с.
Материал любезно предоставил Сидякин Андрей Иванович – к.б.н., ас. каф. ботаники и физиологии растений и биотехнологий и м.н.с. Биотехнологического центра НИЧ Таврического национального университета им. В.И. Вернадского, научный консультант ООО КрымБио