Зародышевый мешок и биотехнология кукурузы in vitro

Культура изолированных зародышевых мешков как биотехнологическая система доращивания зиготических зародышей кукурузы in vitro

Установлена возможность доразвития зародыша кукурузы в культуре изолированных зародышевых мешков на искусственной питательной среде в условиях in vitro от ранней переходной стадии до начала органогенеза. Выяснено, что культивирование зародышевых мешков с целью доращивания зародыша и накопления крахмала в эндосперме должно проводиться более 20 суток. Цвет культивируемого зародышевого мешка может служить маркерным признаком доразвития зародыша и накопления крахмала в эндосперме.

Введение

У цветковых растений зародышевый мешок представляет собой женскую гаметофитную генерацию. До оплодотворения зародышевый мешок наиболее распространенного Polygonum-типа содержит яйцеклетку, две синергиды, центральную клетку с двумя полярными ядрами и три антиподы. После оплодотворения яйцеклетка формирует зародыш, а центральная клетка дает начало эндосперму. Клетки, которые входят в зародышевый мешок до и после оплодотворения, являются эмбрионально молодыми и обладают высокой степенью тотипотентности [4]. Культура изолированных яйцеклеток, зигот, молодых зародышей, эндосперма и целых зародышевых мешков на разных стадиях развития составляет новое, перспективное, но мало разработанное направление биотехнологических исследований в области клеточной и генетической инженерии кукурузы.

Для изолирования зародышевых мешков часто применяют ферментативную мацерацию тканей нуцеллуса, но ферментативное вмешательство затрагивает дальнейшую жизнеспособных зародышевых мешков и дорощенных в них зародышей [8, 15, 16]. Для культивирования изолированных оплодотворенных зародышевых мешков кукурузы с целью доразвития в них зародышей было предложено несколько вариантов питательных сред, которые варьируют по сочетанию минеральных компонентов, содержанию сахарозы и фитогормонов и, иногда, противоречат друг другу [2, 7, 9]. В целом условия и особенности доразвития зародыша и эндосперма внутри культивируемого зародышевого мешка, остаются не выясненными. Не охарактеризованы коррелятивные взаимоотношения между развитием зародыша и эндосперма в данной биотехнологической системе. В связи с этим целью нашей работы было выяснение возможности развития в изолированных зародышевых мешках кукурузы зародыша и эндосперма в культуре in vitro.

Материал и методы исследований

Материалом исследования послужили зародышевые мешки, изолированные из 7-суточных зерновок кукурузы с генотипом зародыша и эндосперма ДК2/477-322хА22. Початки отделяли от донорных растений на 7-е сутки после опыления, удаляли обертки, стерилизовались в 70° этиловом спирте в течение 1-2 секунд и троекратно промывали в стерильной дистиллированной воде. В этот период зародышевый мешок теряет адгезию с тканью нуцеллуса и может быть легко удален из зерновки. Зародышевые мешки механически изолировали и эксплантировали на питательную среду в стерильных условиях ламинар-боксов. Культивирование зародышевых мешков осуществляли на модифицированной питательной среде NBM по R. Mol etal. [9], которая вмещало макросоли N6, микросоли B5, 0,1 мг / л тиамина гидрохлорида, 0,5 мг / л пиридоксина гидрохлорида 0,5 мг / л никотиновой кислоты, 90 г / л сахарозы, 2 мг / л 6-бензиламинопурина и 7 г / л агара. Культивирование проводили в чашках Петри, по 5 зародышевых мешков на чашку при температуре 26^оС в темноте. Анализ результатов культивирования вели на 20-е и 50-е сутки в культуре. Развитие зародышевых мешков и зародышей in vitro оценивали по таким показателям как цвет и линейные размеры зародышевого мешка, наличие, длина и состояние развития зародыша, состояние эндосперма и наличие в нем крахмала. Временные препараты зародышевых мешков для выявления крахмала красили реактивом Люголя. Морфометрических анализ зародышевых мешков и зародышей проводили под микроскопами МБС-1 и ЛОМО МИКМЕД-5, микрофотографии получены с помощью фотоаппарата Canon Power Shot A590 IS.

Результаты и их обсуждение

На 7-е сутки после опыления зерновка гибрида ДК2/477-322хА22 имеет длину около 5 мм. Она содержит прозрачный зародышевый мешок белого цвета (рис. 1, а) длиной 1,75 мм. Внутри зародышевого мешка присутствует зародыш (рис. 1, б) длиной 0,1 мм. В этом возрасте зародыш находится на ранней переходной стадии, т.е. на стадии, когда только произошло выделение суспензора и тела зародыша (рис. 1, в). Эндосперм в настоящее время заканчивает клеткообразование, крахмал в эндосперме отсутствует.

В процессе культивирования изолированных 7-суточных зародышевых мешков наблюдали постепенные изменения внешне-морфологических признаков, а именно цвета, прозрачности, формы поверхности и размеров, что может свидетельствовать об изменении направленности метаболических процессов и определенных морфогенетических преобразованиях культивируемых объектов. Исследование развития культивируемых зародышевых мешков в динамике показало, что к 20-м суткам культивирования большая их часть меняет цвет на желтый и лишь небольшой процент становится бурым (табл. 1). К 50-м суткам культивирования уменьшалась доля желтых и увеличивалась доля бурых зародышевых мешков, из прозрачных они становились непрозрачными.

В процессе культивирования менялась структура и форма поверхности зародышевого мешка, происходило его уплотнение и в отдельных случаях наблюдалось формирование новообразований на его поверхности (рис. 2, г, ґ).

Зародышевые мешки, которые при культивировании меняли форму, с внешней стороны были выпуклыми (рис. 3, д), а со стороны среды – вогнутыми (рис. 3, е, є).

При культивировании изолированных зародышевых мешков наблюдалось увеличение их длины примерно на 48% в 20-е сутки культивирования и на 90% на 50-е сутки по сравнению с длиной зародышевого мешка на момент эксплантации. Существенной разницы по длине зародышевых мешков по фракциям их цвета не найдено (см. табл. 1). На 20-е сутки культивирования увеличение зародышей внутри зародышевых мешков еще не наблюдалось. На 50-е сутки в культуре в отдельных зародышевых мешках визуально отмечен рост и доразвития зародыша от ранней переходной стадии к началу этапа органогенеза (табл. 2).

Зародыши, которые продвинулись в развитии от исходной, ранней переходной стадии к началу этапа органогенеза мы назвали доразвитыми. Такие зародыши увеличивались в длину почти в 5 раз относительно исходного размера. Полученные доразвитые зародыши не формировали проростков при проращивании, вероятно, из-за недоразвития стеблевой и корневой апексов зародыша. Все полученные зародыши были плотными и желто-бурыми (рис. 4, ж, з).

Отмечено, что в измененных по форме, культивируемых желтых и бурых зародышевых мешках зародыш всегда находился на вогнутой стороне, со стороны среды и легко отделялся скальпелем (рис. е, э). Подавляющее большинство доразвитых зародышей было получено в бурых зародышевых мешках (см. табл. 2). Мы предполагаем, что цвет культивированного зародышевого мешка может служить маркерным признаком доразвития зародышей. Образование сформированных зародышей, т.е. зародышей с нормально развитыми органами – щитком, зародышевым корешком, плюмулой, которые бы обеспечивали прорастание, в нашем эксперименте не наблюдалось.

В процессе культивирования зерновок происходило развитие эндосперма. Аккумуляция крахмала в нем становилась заметной лишь на 50-е сутки культивирования. Накопление крахмала наблюдалось исключительно в желтых и бурых зародышевых мешках (см. табл. 2), т.е. цвет культивированного зародышевого мешка может служить маркерным признаком накопления крахмала и развития эндосперма. Тесная связь между накоплением крахмала в эндосперме и развитием зародыша не установлено, поскольку зародышевые мешки, в которых в нашем эксперименте был найдено доразвитые зародыши, или содержали, или не содержали крахмал в эндосперме (см. табл. 2).

Таким образом, проведенное исследование показало, что в изолированных зародышевых мешках на питательной среде, содержащей 90 г / л сахарозы и 2 мг / л 6-бензиламинопурина, наблюдается рост зародыша, но не происходит формирование полноценных точек роста, которые позволили бы при проращивании получить нормальные проростки. Вообще, доращиваниея различных незрелых структур в культуре in vitro до сформированного и зрелого состояния является сложной задачей из-за разных потребностей, в частности, пластических и сигнальных веществ на ключевых фазах развития. Тем не менее, разработаны условия созревания в изолированной культуре in vitro тычинок, пыльцы, завязей и эндосперма кукурузы [3, 5, 10].

Нормальное прохождение основных стадий развития зародыша на растении обеспечивает ряд факторов как генетической, так и физиолого-биохимической и морфогенетической природы. Так, на примере табака показано, что наличие исходной клеточной стенки зиготы играет ключевую роль в установлении его полярности, формировании двухклеточного проэмбрио и нормального суспензора. При отсутствии клеточной стенки или в случае ее регенерации из зиготы развивается каллус или глобулярный зародыш без суспензора [13]. У Arabidopsis thaliana и кукурузы исследованы гены, играющие ключевую роль в дифференциации элементов зародыша. В частности, была доказана активная экспрессия генов синтеза кальмодулина именно в раннем эмбриогенезе кукурузы [11]. У арабидопсиса идентифицировано несколько генов, влияющих на определение и характеристики стеблевой меристемы. Мутации этих генов возвращают развитие зародыша в переходной стадии, тогда как переход к пролиферации стеблевого апекса тормозится. Подчеркивается ведущая роль ауксинов в органогенезе зародыша как сигнальных веществ развития полярности при формировании радикулярного и стеблевого апексов [12].

Доразвитие зародышей в нашей работе было получено в 20-70% зародышевых мешков. Мы предполагаем, что гибридный генотип зародыша и эндосперма мог в некоторой степени, из-за гибридного дизгенеза тормозить развитие этих структур в определенной части зародышевых мешков.

В проведенном нами эксперименте развитие зародыша в изолированных зародышевых мешках происходило до начала органогенеза, а дальше тормозилось. Однако, J. D. Laurie et al. [2] удалось получить развитие зародышей в изолированных зародышевых мешках сформированного строения и формирование проростков. Так, в проведенных исследованиях в качестве объектов были взяты различные формы, можно предположить, что генотип может иметь существенное влияние на результаты культивирования. Но, в целом, переход к органогенезу требует особых специфических условий и проявления ряда факторов, которые могут определять эффективность органогенеза. Известно, что присутствие нескольких слоев нуцеллуса вокруг зародышевого мешка обеспечивает полноценное развитие последнего, путем выделения в среду веществ гормональной природы [2, 15]. Безусловно, важным механизмом регуляции развития зародышей является изменение соотношения фитогормонов в зародыше и окружающей его среде. Некоторые исследователи считают необходимым добавление в питательную среду для созревания зародышевых мешков и зародышей цитокининов, в частности, 6-бензиламинопурина [2, 4]. В нашем экспериментальном материале наличие 2 мг / л 6-бензиламинопурина не обеспечило полного формирования зародышей. Очевидно, в 5-9-суточном возрасте происходят изменения в концентрации фитогормонов в зародышах и зерновках кукурузы. В нескольких публикациях было показано, что в зерновке примерно на 8-е сутки в условиях in vivo концентрация цитокининов достигает максимума (этот возраст соответствует поздней переходной стадии развития зародыша), а позже начинает уменьшаться. Концентрация ауксинов в это время возрастает и начинается дифференциация органов зародыша [7]. Эти сведения свидетельствуют о необходимости дальнейшего исследования роли фитогормонов и, в частности, ауксинов в формировании органов зиготического зародыша кукурузы. До конца невыясненным остается роль эндосперма в созревании зародышей в изолированных зародышевых мешках. В нашем исследовании не выявлено взаимосвязи между развитием зародыша и эндосперма в условиях in vitro. В зародышевых мешках, где интенсивно развивался эндосперм, обязательно происходило развитие зародыша и, наоборот, доразвитые зародыши встречались в зерновках, где развивался эндосперм.

В проведенном эксперименте зародышевые мешки активно меняли при культивировании цвет, форму и структуру поверхности. Установлено, что изменение цвета зародышевого мешка на бурый может служить маркерным признаком того, что внутри него развивается зародыш. В дальнейшем такие зерновки без удаления зародышей можно трансплантировать в другую питательную среду с измененным составом, в частности, фитогормонов, для обеспечения прохождения последующих стадий развития.

Зародыши в нашем эксперименте развивались очень медленно. Так, на 20-е сутки культивирования их еще невозможно было заметить в культивируемых зародышевых мешках, тогда как на растении in vivo зародыши соответствующего возраста составляют около 6-7 мм и легко визуализируются. На 50-е сутки зародыши размером до 0,5 мм можно было наблюдать в части культивируемых зародышевых мешков. Как известно снижения темпов развития зародышей негативно отражается на их формировании и способности к прорастанию [1], поэтому актуальной задачей становится ускорение эмбриогенеза внутри культивируемого зародышевого мешка.

Заключение

Установлена возможность доравзития зародыша от ранней переходной стадии до началу этапа органогенеза в культуре изолированных зародышевых мешков кукурузы. Культивирование зародышевых мешков с целью доращивания зародыша и накопление крахмала в эндосперме должно проводиться более 20 суток. Выявлено, что цвет культивированного зародышевого мешка может служить маркерным признаком доращивания зародышей и накопления крахмала в эндосперме.

Библиографические ссылки

1. Сатарова Т. М. Андрогенез та ембріокультура у кукурудзи in vitro: Автореф. дис… доктора біол. наук. – Дн-ськ, 2003.–42с.
2. A novel technique for the partial isolation of the maize embryo sacs and subsequent regeneration of plants / J. D. Laurie, G. Zhang, I. E. McGann et al. // In Vitro Cell. Dev. Biol. – Plant. – 1999. – Vol. 35. – P. 320–325.
3. Bommineni V. R.Maturation of stamens and ovaries on cultured ear inflorescences of maize (Zea mays L.) // Plant Cell Tissue and Organ Culture. – 1990. – Vol. 23. – P. 59–66.
4. Dumas C. Fertilization and early seed formation // C. Dumas, P. Rogowsky // Comptes Rendus Biologies. – 2008. – Vol. 331, N 10. – P. 715–725.
5. Endosperm cell and organ culture / D. Gruis, H. Guo, Q. Tian, O. A. Olsen // In: Endosperm. Developmental and Molecular Biology. Olsen, Odd-Arne (Ed.). Series: Plant Cell Monographs. –Springer. –2007. – Vol. 8. –P. 111–119.
6. In vitro pollination and fertilization in maize (Zea mays L.): technical procedures and prospects for the dissection of the double fertilization process / J. E .Faure, C. Digonnet, R. Mol et al. // Plant Sci. – 1994. – Vol. 104. – P. 1–10.
7. In vitro development of maize immature embryos: a tool for embryogenesis analysis / E. Matthys-Rochon, F. Piola, E. Deunff et al. // J. Exp. Bot. – 1998. – Vol. 49, N 322. – P. 839–845.
8. Leduc N.Deleterious effect of minimal enzymatic treatments on the development of isolated maize embryo sacs in culture / N. Leduc, E. Matthys-Rochon // Sex Plant Reprod. – 1995. – Vol. 8, N 5. – P. 313–317.
9. Mol R.In vitro culture of fertilized embryo sacs of maize: zygotes and two-celled proembryos can developed into plants / R. Mol, E. Matthys-Rochon,C. Dumas // Planta. – 1993. – Vol. 189, N 2. – P. 213–217.
10. Pareddy D. R. Maturation of maize pollen in vitro / D. R. Pareddy, J. F. Petolino // Plant Cell Rep. – 1992. – Vol.11. – P. 535-539.
11. PCR-generated cDNA library of transition-stage maize embryos: cloning and expression of calmodulin genes during early embryogenesis / C. Breton, A. Chaboud, E. Matthys-Rochon et al. // Plant Mol. Biol. – 1995. – Vol. 27. – P. 105–113.
12. Souter M. Polarity and signaling in plant embryogenesis / M. Souter, K. Lindsey // J. Exp. Bot. – 2000. – Vol. 51, N 347. – P. 971–983.
13. Tobacco zygotic embryogenesis in vitro: the original cell wall of the zygote is essential for maintenance of cell polarity, the apical-basal axis and typical suspensor formation / Y.-C. He, Y.-Q. He, L.-H. Qu et al. // Plant Journal. – 2007. – Vol. 49, issue 3. – P. 515–527.
14. Van Lammeren A. A.Observations on the structural development of immature maize embryos (Zea mays L.) during in vitro culture in presence or absence of 2,4-D /A. A. Van Lammeren// Acta Bot. Neerl. – 1988. – Vol. 37, N 1. – P. 49–61.
15. Wagner T. V.Observations on the isolated embryo sac of Zea mays L./T. V.Wagner  // Plant Sci. – 1989. – Vol. 59. – P. 127–132.
16. Zea mays embryo sacs in culture. Plant regeneration from 1 day after pollination embryos / M. K. Campenot, G. Zhang, A. J. Culter, D. D. Cass // Amer. J. Bot. – 1992. – Vol. 79. – P. 1368–1373.

Источник: Ляпустіна О.В. Культура ізольованих зародкових мішків як біотехнологічна система дорощування зиготичних зародків кукурудзи in vitro / О.В. Ляпустіна, Т.М. Сатарова // Вісник Дніпропетровського університету. Біологія. Екологія. – 2009. – Вип. 17, Т. 3. – С. 54-61.

Автор фото в статье: Ляпустина Е.В.