Вы здесь

Изоляция гамет кукурузы

Голосов еще нет
Изоляция гамет кукурузы

В последнее время обострился интерес к изучению механизмов половой репродукции у цветковых растений на качественно новом уровне. Совершенствование техники изоляции мужских и женских гамет, их слияние, эндоспермиогенез и эмбриогенез in vitro из полученных в результате искусственного оплодотворения зигот открывают широкие перспективы для изучения механизма двойного оплодотворения, открытого С. Г. Навашиным в 1898 году. Женскими гаметами, участвующих в оплодотворении, у покрытосеменных является яйцеклетки, содержащие гаплоидный набор хромосом, и центральная клетка зародышевого мешка, содержащего диплоидный набор хромосом. Мужскими гаметами, участвующих в процессе оплодотворения, является гаплоидные клетки-сперматозоиды, доставляемые в зародышевый мешок пыльцевой трубкой. Слияние одного из спермиев с яйцеклеткой приводит к развитию диплоидного зародыша, а слияние второго спермия с центральной клеткой зародышевого мешка дает толчок развитию триплоидному эндосперму.

Собственно процесс оплодотворения и особенно ранние этапы развития зародыша и эндосперма in vivo проходят при глубоком погружении в ткани материнского организма - нуцеллуса и интегументов, которые после оплодотворения формируют соответственно перисперм (у некоторых видов) и семенную оболочку. Искусственное оплодотворение растений in vitro подразумевает изоляцию гамет и их принудительное слияние. Данная техника состоит из нескольких этапов, которые вместе позволяют эффективно осуществлять этот сложный природный процесс. Этими этапами являются изолирование зародышевых мешков и яйцеклеток, изолирование спермиев, слияние гамет in vitro, культивирование зигот и зиготусодержащих зародышевых мешков, культура молодых зиготических зародышей и эндосперма.

Для изоляции гамет, а именно зародышевых мешков и яйцеклеток семязачатки кукурузы отделяют от зрелых неопыленных початков и инкубируют в энзиматическом растворе, содержащем 0,5% мацерозима, 0,5% целлюлазы, 0,75% пектиназ и 0,25% пектолиазы в питательной среде, включающей макросоли N6, микросоли В5, витамины по Мурасиге-Скуга, 12% сахарозы и 1 мг / л зеатина [4]. Затем зародышевые мешки и яйцеклетки выделяют тонкими иглами, после чего они положительно окрашиваются флуоресциндиацетатом. Показано наличие сложной оболочки из целлюлозы и калозы вокруг выделенного зародышевого мешка. После выделения вокруг него сохраняется некоторое количество нуцеллярных клеток. Яйцеклетка после изоляции становится сферической, но структура ее органелл сходна с таковой in situ [2, 3].

Для изоляции спермиев у кукурузы используется рН-шок. При низких значениях рН происходят изменения в Zwischenkorper-слое пыльцевого зерна, вследствие чего цитоплазма вегетативной клетки и мужские гаметы выходят через апертуру [1]. Эффективность выделения сперматозоидов зависит от качества пыльцы, содержания воды, которая должна оставаться на уровне 50-60%. Мужские гаметы, освободившиеся могут быть отделены от цитоплазмы вегетативной клетки с помощью центрифугирования в градиенте перкола и фильтрации [5]. Спермии оставались жизнеспособными после замораживания при минус 80oС и оттаивании до +37oС в среде с глутамином [6]. G. Zhang et al. [7] показали увеличение синтеза ДНК и белка после изоляции спермиев, что указывает на их активацию после выхода из пыльцевого зерна in vitro. Две мужские гаметы одного и того же пыльцевого зерна не проявляли морфологических различий. Спермии кукурузы сразу после изоляции часто имели веретеновидные форму, но быстро становились округлыми и выглядели как протопласты, содержали различной формы гетерохроматизованные и негетерохроматизованные ядра, что могло быть связано с различиями в фазах клеточного цикла. Признаки автономной подвижности изолированных спермиев не обнаружены [1].

Список литературы

  1. Chabond A., Perez R. Generative cells and male gametes: isolation, physiology and biochemistry // Int. Rev. Cytol. – 1992. – Vol.140. – P.205 – 232.
  2. Faure E., Mogensen C., Kranz E., Digonnet C., Dumas C. Ultrasrtructural characterization and three-dimensional reconstruction of isolated maize (Zea mays L.) egg cell protoplasts // Protoplasma. – 1992. – V.171. – P.97 – 103.
  3. Matthys-Rochon E., Digonnet C., Dumas C. Characterizations of Zea mays embryo sac using fluorescent probes and microinjection of Lucifer yellow into the female cells //Biotechnology applications of microinjection, microscopic imaging and fluorescence. – NY.: Plenum Press, 1992. – P.53 – 60.
  4. Mol R., Matthys-Rochon R. E., Dumas C. Embryogenesis and plant regeneration from maize zygotes by in vitro culture of fertilized embryo sacs // Plant Cell Rep. – 1995. – Vol.14. – P.743 – 747.
  5. Roeckel P., Dupuis I., Detchepare S., Matthys-Rochon E., Dumas C. Isolation and viability of sperm cells from corn (Zea mays) and rape (Brassica oleracea) pollen grains. – In: "Plants Sperm Cells as Tools for Biotechnology". – Pudoc, Wageningen, 1988. – P.105 – 110.
  6. Roeckel P., Dumas C. Survival at 20оC and cryopreservation of isolated sperm cells from Zea mays pollen grains //Sex. Plant Rep. – 1993. – V.6. –P.212 –216.
  7. ZhangG., GiffordD., CassD.RNA and protein synthesis in sperm cells isolated from Zea mays L. pollen // Sex. PlantReprod. – 1993. – Vol.6. – P.239 – 243.

Автор статьи и фото в статье: Ляпустина Е.В.

Добавить комментарий

CAPTCHA
Этот вопрос задается для того, чтобы выяснить, являетесь ли Вы человеком или представляете из себя автоматическую спам-рассылку.