Вы здесь

Стерилизация растительного материала

Голосов еще нет
Стерилизация

Процесс стерилизации интактного растительного материала, из которого в дальнейшем вычленяют экспланты (группы клеток, ткани или целые органы), необходимо производить с особой тщательностью, поскольку от этого зависит, будет ли эксплант развиваться или погибнет от инфекции. Однако часто внутреннее заражение исходных эксплантов бывает намного сильнее, чем поверхностное, поэтому экспланты предварительно обрабатывают фунгицидами и антибиотиками против грибковой и бактериальной инфекций. Хорошие результаты дает обработка растительного материала бензоатом натрия. Более того, необходим тщательный фитосанитарный уход за исходными растениями.

Процесс стерилизации растительного материала можно условно разделить на несколько этапов. На первом этапе отобранные интактные части растений механически очищают от лишних частей (чешуйчатые листья, основания сидячих листьев и пр.). Затем растительный материал тщательно (2-3 раза) промывают под проточной водой и в слабом растворе калийного мыла, опять ополаскивают проточной водой. После этого части растений разрезают на сегменты такого размера, чтобы они могли свободно помещаться в сосуды со стерилизаторами, и заливают дистиллированной водой. Затем переходят ко второму этапу стерилизации, который, как правило, проводится уже в ламинарном боксе.

Меристемы изолируют под бинокулярным микроскопом или с использованием лупы. Препаративной иглой или хирургическим скальпелем отодвигают листья (оболочки) и вырезают меристему с помощью 4 надрезов вокруг бугорка, а потом подрезают снизу. После вычленения эксплант помещают в сосуд с питательной средой и переносят в культуральное помещение.

Второй этап — это собственно стерилизация, которую удобно проводить в следующей последовательности.

В ламинарном боксе расставляют необходимое количество стерильных стаканов на 250 мл, которые сверху накрывают простерилизованными половинками чашек Петри. В стаканы в той очередности, в которой будут проводиться стерилизационные мероприятия, наливают растворы стерилизаторов, чередуя их со стаканами, наполненными стерильной дистиллированной водой.

В растворы можно добавлять по несколько капель так называемых увлажнителей/прилипателей (tween-20, citowett, sandowit) для снижения поверхностного натяжения и улучшения смачиваемости поверхности эксплантов. После обработки хлор- и ртутьсодержащими препаратами необходимо осуществлять двухкратную промывку стерильной водой. Стерилизация начинается со стакана с 70%-ым этиловым спиртом и заканчивается 1-2 стаканами со стерильной дистиллированной водой для промывки. Растительные объекты удобно помещать в отдельные стерильные марлевые мешочки – это существенно упрощает процесс стерилизации. Мешочки, прошедшие серию растворов-стерилизаторов, раскладывают между стерильными салфетками из фильтровальной бумаги для удаления лишней влаги.

На заключительном этапе стерильным инструментом вычленяют интересующие участки растительных тканей и переносят их на питательную среду. Для обеспечения максимальной стерильности все манипуляции удобно проводить на стерильных одноразовых салфетках из фильтровальной бумаги. Перед вычленением каждого экспланта инструмент необходимо обжечь в пламени горелки. Удобно иметь набор скальпелей и пинцетов (20-30 штук), который лучше всего хранить в специальных конвертах из бумаги “крафт”. Экспланты помещают в отдельные емкости; чаще это сахарные пробирки или небольшие колбы с минимальным объемом питательной среды.

Для стерилизации семян и органов интактных растений используют различные вещества. Наиболее применяемы в практике растворы, содержащие активный хлор: гипохлорид кальция и натрия, хлорная известь, хлорамин. Следует подбирать такие концентрации, которые не повреждали бы ткани, не воздействовали на всхожесть семян и одновременно обеспечивали максимальную стерильность растительных образцов.

Часто для стерилизации применяют растворы соединений ртути – сулему, диацид, famosept, thimerosal. Эти вещества при правильном выборе концентрации и экспозиции дают удовлетворительные результаты, несмотря на их токсичность для растительных тканей. После стерилизации в ртутьсодержащих препаратах необходима тщательная промывка в 3-4 порциях стерильной дистиллированной воды. Кроме того, отработанные растворы требуют соответствующей утилизации. В качестве стерилизующего агента также применяют пероксид водорода (Н202), который, менее всего повреждает ткани; после его применения отпадает необходимость продолжительной промывки, так как это вещество быстро разлагается.

При введении в культуру in vitro иногда наблюдается побурение тканей экспланта, возникающее в результате механических повреждений отдельных тканей как результат окисления фенолов, что характерно для многих видов. В дальнейшем это приводит к отмиранию эксплантов. Для удаления фенолов в воду для промывки можно добавлять 1-10%-й раствор L-цистеина, а процесс вычленения проводить в стерильном растворе аскорбиновой кислоты в чашках Петри.

Источник: Биотехнология тропических и субтропических растений in vitro

Добавить комментарий

CAPTCHA
Этот вопрос задается для того, чтобы выяснить, являетесь ли Вы человеком или представляете из себя автоматическую спам-рассылку.