Липиды в клетках дрожжей содержаться в двух состояниях: в свободном виде (в виде включений) и в связанном состоянии. «Свободные» липиды вообще лучше всего извлекать с помощью смеси двух нейтральных растворителей метанола и хлороформа, «связанные» же липиды обычной экстракцией извлечь невозможно без предварительной обработки. Поэтому с целью максимального извлечения липидов, предварительно проводят экстракцию растворителем метанол-хлороформ, а затем обработкой раствором щелочи (КОН, NAOH) или кислотой (H2S04, HC1) с последующим их восстановлением. Также следует учесть, что может пройти неполное восстановление полярных фосфолипидов, если нет достаточного количества воды в среде извлечения. Фосфолипиды лучше всего извлекать гидратаций в слабокислой среде, хотя известны случаи, когда их извлечения проводилось с помощью комплексного растворителя: этанол-вода-диэтиловый эфир-пиридин (15:15:15:1), но при этом извлекались только ди-и трифосфолипиды.
Механическое разрушение клетки и высушивание дрожжей при умеренных температурах также увеличивается извлечения количества липидов. Следует учесть, что при повышении температуры высушивания выше 80°С возможно разложения белковых компонентов. Активация мембраных фосфолипаз может возникнуть при обработке клеток ацетоном или водным этанолом при комнатной температуре. Такого же результата можно добиться нагрева клеток дрожжей с 80%-ым водным раствором этанола при температуре 80 ° С в течение 15 минут. После этого липиды из дрожжей можно извлечь с помощью растворителя метанол-хлороформ (2:1, об / об). Таким образом, после предварительной подготовки с последующей экстракцией может получится завышен содержание липидов из за большого содержания жирных кислот, которые вышли после восстановления фосфолипидов. Поэтому, содержание жира в дрожжах, о которых сообщают, могут быть связаны с условиями извлечения. Большинство возобновляемых результатов были получены после гидролиза и восстановления полного жирно-кислотного компонента, который затем представляется как суммарное содержание липидов в дрожжах.
Из многих липидообразующих дрожжей промышленный интерес представляют дрожжи C.guilliermondii, алканы, что утилизировали. Они синтезируют в основном фосфоли уйди. Накапливают большие количества липидов и активно развиваются на углеводородных субстратах (на патоке, гидролизате торфа и древесины) также дрожжи видов Lipomyces lipoferus и Rhodotorula gracilis.
Соотношение насыщенных и ненасыщенных кислот зависит не только от свойств продуцента, но и от условий культивирования. Низкая температура стимулирует синтез ненасыщенных жирных кислот у грибов. Общее количество и соотношение жирных кислот зависит и от присутствия К, Mg, Na и их соотношение в среде.
Синтез липидов стимулируют ингибиторы углеводного обмена, например арсенит натрию.Оскилькы для производства липидов микробного происхождения может быть использовано дешевое сырье, они в перспективе могут заменить жиры и масла растительного и животного происхождения, используемые для технических нужд. Такой дешевой исходным сырьем является гидролизат древесины или торфа, а также продукты нефти. Чтобы в клетках микроорганизмов накопилось максимальное количество липидов, во время ферментации необходимо лимитировать количество азота и вести ее в аэробных условиях. За сутки в биомассе дрожжей Rhodotorula gracilis может образоваться 50-60% липидов. Содержание белков в биомассе при таких условиях уменьшается до 10-20%. На синтез 1 г липидов расходуется около 6 г сахара.
Как пример можно привести культивирования дрожжей Lipomyces lipoferus на гидролизате торфа, нейтрализованы известковым молоком до рН 6,0 и содержат 1,5% сахара.
К среде добавляют дополнительно КН2РО4-0,1 г / л, MgS04 — 0,04 г / л и СаCl2 — 0,04 г / л. Содержание азота в гидролизате вполне достаточно для роста культуры.
Содержание липидов в биомассе после 4-5 сут выращивания составляет 50% по сухому веществу. В их состав входят: фосфолипиды — 5,0 — 6,0% стерины — 4,8 — 6,5% моно-и диглицериды — 2,1 — 10,7% свободных жирных кислоты — 2,3-9,6% триглицериды — 70,7-75,1% эфиров стеринов и воска — 1,7-2,1%.
Липиды в данном случае выделяют из биомассы экстракцией эфиром. Из 1 т сухого торфа можно получить 40-50 кг липидов. По физико-химическим свойствам они близки к растительных масел, которые используют во многих отраслях промышленности для технических нужд. Возможно отобрать такие культуры микроорганизмов и создать условия культивирования, чтобы в биомассе накапливались меньше липидов (15-30%), но больше белков (30-40%) — В этом случае после экстракции липидов получают ценный кормовой препарат — микробную жмых. В последнее время доказано, что микроорганизмы могут выделять липиды из клеток в культуральную жидкость. Культура дрожжей Rhodotorula glutinis выделяет из клеток уксусную (40%), миристиновая (1%), пальмитиновую (14%), стеариновой (1,5%), олеиновую (29%), линолевой (3%), линоленовой (0,5 %) и 3-дигидроксигексадекановую (8,5%) кислоты (данные приведены в процентах к общей массе экстрацеллюлярного липидов). При культивировании Candida bogoriensis в среде образуются игольчатые кристаллы липидов с температурой плавления 74-76°С. Эти кристаллы состоят из углерода софорозы и гидро-ксигокозановой кислоты, соединенных гликозидной связью.
Состав липидов, полученных из дрожжей весьма многообразен. В их состав входят нейтральные жиры (триглицериды), моно-, диглицериды, свободные жирные кислоты, стеролы, углеводороды, фосфолипиды, сфинголипиды и гликолипиды.
Жирно-кислотный состав липидов дрожжей основном состоит из жирных кислот С16 и т.д. С is, хотя встречаются определенные виды дрожжей где их состав может отличаться. В целом в дрожжевой клетке было выявлено 33 жирные кислоты в пределах от Это в С26, включая существенные количества кислот изо-строения. Встречаются виды в состав которых входят жирные кислоты от С20 до СЗО, но они составляют только 1 — 2% от полного жирно-кислотного состава. В пивоваренных и хлебопекарных дрожжах преобладают насыщенные жирные кислоты от Cs до. В дрожжах преобладают жирные кислоты Cigri, есть олеиновая кислота, содержание же кислот С 18:2 и С 18:3, обычно малохарактерно для дрожжей и свтречаются только в некоторых видах (Mucor rouxii). Также было выявлено очень низкие количество вакценовой кислоты (транс-11-Октадеценова кислота) и следы цикло-проапновых жирных кислот, оба из которых являются главными жирными кислотными компонентами многих бактериальных липидов и в некоторых видах дрожжей. Главный кислотный остаток в видах С. lipolytica и С. tropicalis выращенных на определенных n-алканах был идентифицированы как 17:1.
Так, в липидах плесневого гриба Penicillium soppii из жирных кислот содержатся (от общего количества):
- Пальмитиновая кислота — 22%
- Стеариновая кислота -7,6%
- Олеиновая кислота — 45,2%
- Линолевая кислота — 20%.
Есть также сведения что в липидах (в растворенном виде) идентифицируются углеводороды. Было выявлено более 40 изомеров алканов с нормальным и разветвленной цепью, в пределах от С20 до С30 Такие углеводороды встречались в дрожжах Saccharomyces oviformis и Saccharomyces ludwigii.
Особое место в липидах дрожжей занимают фосфолипиды, которые могут содержатся в клетках от 3-х до 7% в пересчете на сухой вес. Эти фосфолипиды имеют сложный химический состав и преимущественно состоят из: фосфатидилхолин (35-55%), фосфаты-дилэтаноламин (20-32%), фосфатидилинозит (9-22%) и фосфатидилсерин (4-18%).
Микроскопические грибы пока не получили промышленного распространения из-за сложности выделения и переработки полученных липидов. Но при этом дрожжи проводят разнообразные жирные кислоты (содержащие от 10 до 20 атомов углерода), что важно для получения специфических жирных кислот, которые могут применяться в различных направлениях, в частности в фармацевтике. Также сохраняется тенденция в исследовании жиросодержащих дрожжей как заменители пищевых жиров.
В результате возникновения глобальной проблемы относительно исчерпания энергетических ископаемых ресурсов, и черту глобального потепления группы ученых занимающихся разработкой, а также выводом технологий по производству биотоплива на промышленный уровень.
Производство биодизельного топлива из зеленой водоросли В.braunii является не только экологически чистым, но и финансово выгодным. Кроме того водорослевая биомасса является восстановительным энергоресурсом.
Хотя водорослевое биотопливо является очень привлекательным, все же не является панацеей в борьбе с экологическими проблемами. Водорослевые фермы обходят кукурузные и рапсовые поля только по показателю экономии территории и истощению почвы.
Весьма перспективным является также исследования и разработки промышленного получения энергоемких химических соединений с жиросодержащих дрожжей. Хотя есть определенные неудобства во внедрении массового выпуска дрожжевого биотоплива, однако этой проблеме может быть посвящена моя следующая работа.
Автор статьи: Дохторук Андрей, ст. каф. Микробиология и вирусология, Днепропетровского национального университета им. Олеся Гончара